[发明专利]一种农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法

说明书

 

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，特别涉及一种农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法。

背景技术

地黄（Rehmannia glutinosa L.）为玄参科多年生草本植物，以块根入药，是著名“四大怀药”之一。因其用药历史悠久、临床疗效确切，已成为构建我国现代大中药产业链重点推荐研究利用的大宗药材之一（黄璐琦等, 中国科技投资, 2010, 5: 67-69）。目前在河南省焦作地区种植面积已经超过1.5万公顷，产值数十亿元。然而，由于地黄生产上多以块根进行无性繁殖，更易遭受病原菌和病毒侵袭而发病。而且，地黄生产上存在非常严重的连作障碍问题，造成地黄产量和品质明显下降，种植过地黄的土地须隔8-10年方可再种。培育脱毒地黄虽然能够提高地黄的产量，但并没有改变地黄的遗传特性，病毒复侵速度快，2-3代就要更换一次种苗，成本高。这些都在很大程度上影响了地黄生产的稳定发展，也制约了地黄产业链现代化的进程。近年来，由于高通量DNA测序技术的发展，地黄的基因转录本不断被解析，可获取的与地黄产量形成和活性成分合成调控的基因信息越来越多。因此，通过遗传转化的方法对地黄的遗传特性进行修饰，对于获得产量高、活性成分含量高和抗病虫能力强的优良地黄品种具有较强的现实意义。

地黄是较早开展组织培养技术的药用植物之一，然而，有关怀地黄遗传转化的研究却很少。付建喜等（河南农业科学, 2007, 10: 72-76）报道用发根农杆菌侵染地黄子叶、叶柄和茎，获得了转基因地黄植株。然而，由于发根农杆菌转化的转基因植株普遍表现地上部分节间缩短、地下部分以须根为主（张荫麟等，中国中药杂志, 1997, 5: 274-275），而且Ri质粒改造技术滞后，限制了其在植物基因组的遗传修饰方面的应用。韩国的Park等（Biotechnology letters, 2002, 7: 547-550）虽然最早报道获得了根癌农杆菌介导的地黄转化植株，然而，作为转化受体的地黄种质不明，且转化程序较复杂。臧亚超（河北农业大学硕士学位论文, 2012）虽也获得了地黄转基因植株，但由于抑菌抗生素浓度过高（氨苄青霉素600 mg/L），再生芽分化慢，转化效率也很低。因此，构建转化程序简单、转化效率高、重复性好的怀地黄遗传转化再生体系仍是地黄种质遗传改良中亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有地黄遗传转化技术的不足，提供一种以怀地黄初展开的叶片为转化外植体受体，通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法，把外源基因导入怀地黄受体细胞，经过筛选再生获得怀地黄转基因植株的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，以怀地黄无菌苗初展开叶片去叶脉后剪成叶盘作为根癌农杆菌感染的受体，经农杆菌侵染、共培养、抗性愈伤诱导、抗性芽分化、抗性芽生根，最终获得地黄的转基因植株。

叶盘被农杆菌侵染后先接种在无筛选抗生素的培养基上共培养48-72 h，之后接种到含有潮霉素或卡那霉素的筛选培养基上获得抗性愈伤和抗性芽，再把抗性芽接种到增殖培养基上增殖，在生根培养基上生根，获得转基因地黄植株。

优选的，怀地黄无菌苗的准备如下：将田间挖取的直径约1-2 cm的怀地黄块根洗净，依次用酒精和HgCl₂消毒，之后无菌水冲洗5-6次；将带芽眼的部分切成1.5-2 cm小块放入MS基本培养基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，15 d后把再生芽转至新的MS基本培养基，30 d继代一次。

优选的，根癌农杆菌菌株的活化与侵染菌液的制备如下：把鉴定正确的根癌农杆菌在YEB固体培养基上划线活化，于27℃下，暗培养48 h；挑取单克隆菌落接种到20-30 mL YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养24 h；取100 μL上述菌液接种到50 mL的YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养，菌液浓度至OD₆₀₀=0.4-0.8，于4℃，4000 rpm条件下离心10 min收集菌体，弃上清，用侵染培养基悬浮至OD₆₀₀=0.5获得侵染菌液待用。

所述的YEB液体培养基为：YEB基本培养基+卡那霉素50 mg/L+利福霉素50mg/L+蔗糖5 g/L；所述的YEB固体培养基还含有琼脂粉15 g/L；所述的侵染培养基为：MS基本培养基+乙酰丁香酮100 μmol/L+蔗糖30 g/L。