[发明专利]复制缺陷型BmNPV载体的构建及应用

权利要求书

1.转移载体pMD18-lef2-BAC-1629的构建方法，其特征是包括以下步骤：

1）、pMD18-lef2-1629载体构建：

①、分别进行BmNPV lef2基因片段和orf1629基因片段的合成，

②、利用BmNPV lef2基因片段和orf1629基因片段重叠PCR合成lef2-1629片段；

③、构建pMD18-lef2-1629：

先对lef2-1629片段3'端加“A”，所得的加“A”后的PCR产物连接到T载体，得pMD18-lef2-1629；

2）、转移载体pMD18-lef2-BAC-1629的构建：

①、细菌人工染色体BAC片段的合成

以bMON14272DNA作为模板，利用KOD FX DNA聚合酶PCR扩增BAC片段，得BAC片段PCR产物；

②、BAC片段克隆到pMD18-lef2-1629：

先将pMD18-lef2-1629与BAC片段PCR产物分别用FseI进行单酶切反应；pMD18-lef2-1629酶切产物割胶回收后去磷酸化，再与酶切回收的BAC片段PCR产物用DNALigation Kit LONG试剂盒进行连接，连接产物转化HST08感受态细胞，得转移载体pMD18-lef2-BAC-1629。

2.复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法，其特征是：首先构建家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid，再利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列，从而构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid；该复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid可以构建重组病毒表达目的蛋白。

3.根据权利要求2所述的复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法，其特征是：

所述家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid的构建为：

取转移载体pMD18-lef2-BAC-1629DNA和四方形多角体BmNPV病毒DNA混匀后与X-tremeGENE HP转染试剂混合共转染单层家蚕BmN细胞；所得的病毒基因组DNA电转化ElectroMAX DH10B感受态细胞，涂布于Kan/IPTG/X-gal LB固体培养基上培养24～48h；然后转印至Amp/IPTG/X-gal LB固体培养基上培养12h，随机挑取Kan抗性Amp敏感的蓝色单菌落接种Kan LB液体培养基（50μg/mL Kan），37℃摇床中220r/min振荡培养48h；得穿梭载体BmBacmid，含该穿梭载体BmBacmid的DH10B细胞标记为BmDH10B。

4.根据权利要求3所述的复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法，其特征是：

所述利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列，从而构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid包括以下步骤：

1）、orf1629基因打靶片段的制备

根据四方形多角体BmNPV病毒orf1629基因及pKD3质粒中氯霉素抗性基因表达盒序列设计引物；然后以pKD3质粒DNA作为模板，KOD FX DNA聚合酶进行扩增；PCR产物纯化后，得orf1629基因打靶片段；

2）、Red重组构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid：

以pKD46-RecA质粒转化BmDH10B感受态细胞，在Amp/Kan LB平板上筛选阳性克隆，得BmDH10B感受态细胞；

所述BmDH10B感受态细胞以orf1629基因打靶片段电转化后，进行筛选培养；得复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid。

5.如权利要求2～4任一方法构建而得复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的用途，其特征是：用于构建重组病毒表达目的蛋白。