[发明专利]复制缺陷型BmNPV载体的构建及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术中利用基因工程方法载体构建的技术领域。 

背景技术

昆虫杆状病毒表达系统主要有两个，一个是应用最为广泛以Sf9、Sf21细胞或苜蓿银纹夜蛾为宿主的AcMNPV载体表达系统，另一个是感染家蚕细胞或幼虫、蛹表达外源基因的家蚕杆状病毒（BmNPV）表达载体系统。在这种表达系统中重组病毒的成功构建是关键。早期的BmNPV载体系统产生重组病毒效率低，需要繁琐耗时的多步筛选步骤。目前主要是以BmBacmid或者线性化的BmNPV为主构建重组病毒，表达目的蛋白。最近还出现了一种利用条件性复制载体转座构建重组BmBacmid的技术，利用这种技术可大大提高筛选重组BmBacmid的成功率。不过，这种操作仍然需要在特定的大肠杆菌中完成，无法脱离这个中间步骤。总之，虽然现在的技术和方法相比较早期的技术有很大进步，但最终成功构建重组病毒还是需要多步操作，相对还是比较繁琐耗时的。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种复制缺陷型BmNPV载体的构建及应用；本发明利用同源重组的方法构建穿梭载体BmBacmid，进而通过Red重组技术构建一种复制缺陷型的BmNPV载体。利用这种复制缺陷型载体可一步构建重组病毒，无需筛选，从而建立一种快速构建BmNPV重组病毒表达目的蛋白的方法。 

为了解决上述技术问题，本发明提供一种转移载体pMD18-lef2-BAC-1629的构建方法，包括以下步骤： 

1）、pMD18-lef2-1629载体构建： 

①、分别进行BmNPV lef2基因片段和orf1629基因片段的合成， 

②、利用BmNPV lef2基因片段和orf1629基因片段重叠PCR合成lef2-1629片段； 

③、构建pMD18-lef2-1629： 

先对lef2-1629片段3'端加“A”，所得的加“A”后的PCR产物连接到T载体（pMD18-Tsimple），得pMD18-lef2-1629； 

2）、转移载体pMD18-lef2-BAC-1629的构建： 

①、细菌人工染色体BAC片段的合成 

以bMON14272DNA作为模板，利用KOD FX DNA聚合酶PCR扩增BAC片段，得BAC片段PCR产物； 

②、BAC片段克隆到pMD18-lef2-1629： 

先将pMD18-lef2-1629与BAC片段PCR产物分别用FseI进行单酶切反应；pMD18-lef2-1629酶切产物割胶回收后去磷酸化，再与酶切回收的BAC片段PCR产物用DNALigation Kit LONG试剂盒进行连接，连接产物转化HST08感受态细胞，得转移载体pMD18-lef2-BAC-1629。 

本发明还同时提供了复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法，首先构建家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid，再利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列，从而构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid；该复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid可以构建（快速构建）重组病毒表达目的蛋白。 

作为本发明的复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法的改进： 

家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid的构建为： 

取转移载体pMD18-lef2-BAC-1629DNA和四方形多角体BmNPV病毒DNA混匀后与X-tremeGENE HP转染试剂混合共转染单层家蚕BmN细胞；所得的病毒基因组DNA电转化ElectroMAX DH10B感受态细胞，涂布于Kan/IPTG/X-gal LB固体培养基上培养24～48h；然后转印至Amp/IPTG/X-gal LB固体培养基上培养12h，随机挑取Kan抗性Amp敏感的蓝色单菌落接种Kan LB液体培养基（50μg/mL Kan），37℃摇床中220r/min振荡培养48h；得穿梭载体BmBacmid，含该穿梭载体BmBacmid的DH10B细胞标记为BmDH10B。 

作为本发明的复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法的进一步改进：利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列，从而构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid包括以下步骤： 

1）、orf1629基因打靶片段的制备