[发明专利]番茄种传病原多重PCR检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种番茄种传病原多重PCR检测试剂盒，番茄种传病原为马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒或烟草环斑病毒，其特征在于包括以下组分：

RT-PCR buffer，2×RT-PCR buffer，100-250μL；RT-PCR扩增引物为马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd上游引物，浓度为10μmol/L，10-30μL；马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd下游引物，浓度为10μmol/L，10-30μL；凤果花叶病毒PepMV上游引物，浓度为10μmol/L，10-30μL；凤果花叶病毒PepMV下游引物，浓度为10μmol/L，10-30μL；烟草环斑病毒TRSV上游引物，浓度为10μmol/L，10-30μL；烟草环斑病毒TRSV下游引物，浓度为10μmol/L，10-30μL；反转录酶及DNA聚合酶Mix，20μL；无RNA酶的去离子水，100μL-1mL；阳性对照，马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd、凤果花叶病毒PepMV和烟草环斑病毒TRSV无侵染活性的阳性对照各20-60μL。

2.如权利要求1所述的番茄种传病原多重PCR检测试剂盒，其特征在于所述的RT-PCR扩增引物为：

马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd上游引物为：5′-ATTCCCGCCGAAACAGG-3′；

PSTVd下游引物为：5′-CCCGAAGCAAAGAAGATAGAGAAA-3′；

凤果花叶病毒PepMV上游引物为：5′-ATGAGGTTGTCTGGTGAAGGTC-3′；

PepMV下游引物为：5′-AATTCCGTGCACAACTATGATTC-3′；

烟草环斑病毒TRSV上游引物为：5′-CTTGCGGCCCAAATCTATAA-3′；

TRSV下游引物为：5′-ACTTGTGCCCAGGAGAGCTA-3′。

3.一种番茄种传病原多重PCR检测方法，其特征在于包括有：

1）总核酸提取：

2)RT-PCR反应体系为50μL，其中2×RT-PCR buffer25μL，RT/Taq Mix1.0-2.0μL，马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd上下游引物10μmol/L各0.6-1.6μL，凤果花叶病毒PepMV上下游引物10μmol/L各0.2-1.0μL，烟草环斑病毒TRSV上下游引物10μmol/L各0.2-1.0μL，总RNA模板2.5-8μL，灭菌去离子水补足反应总体积；

3)RT-PCR反应条件为：

cDNA合成：50℃30min，1个循环；

PCR扩增：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min；

4）RT-PCR扩增产物电泳检测：

用TAE电泳缓冲液制备1.5%琼脂糖凝胶，在室温下进行水平电泳。加10μLPCR扩增产物，以健康番茄总核酸的反转录PCR产物为阴性对照，以DL1000Marker为标准分子量；100V/80mA下电泳30min，用SYBR Safe代替EB染色，用凝胶成像系统观察并拍照，马铃薯纺锤块茎类病毒扩增产物为一条163bp的条带，凤果花叶病毒扩增产物为一条625bp的条带，烟草环斑病毒扩增产物为一条348bp的条带。

4.如权利要求3所述的番茄种传病原多重PCR检测方法，其特征在于所述的核酸提取包括有如下步骤：

（1）取感染马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒或烟草环斑病毒的番茄叶片；称取0.1g感染病毒样品组织倒在洁净的研钵内，加液氮研磨成粉末状；

（2）移入1.5mL离心管中，然后加入1mL的TRIzol，剧烈振荡3min以上；

（3）在4℃下，12000rpm离心10min以除去不溶成分，将上清液转入另一新的1.5mL离心管中；

（4）在室温下静置5min，加0.2mL氯仿/mL TRIzol，剧烈振荡15s，然后在室温下静置15min，再于4℃、12000rpm的条件下离心15min；

（5）将上层水相转移到新的1.5mL离心管中，加0.5mL异丙醇/mLTRIzol，上下颠倒混匀，室温静置15min；

（6）4℃、12000rpm离心10min；

（7）弃上清，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4℃、7500rpm离心2min，弃乙醇；

（8）沉淀在室温下干燥10min或在冷冻离心浓缩机上浓缩5min，加入30μL无RNase水溶解，-70℃保存备用。