[发明专利]番茄种传病原多重PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种番茄病害的检测方法，主要针对番茄的3种重要种传病原马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒和烟草环斑病毒的同时检测。

背景技术

番茄病毒病是由多种病毒引起的重要病害，是番茄上发生最普遍、最难防治的病害之一，分布于世界各番茄产地。马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒和烟草环斑病毒均可引起番茄病毒病。马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid，PSTVd）是我国进境植物检疫性有害生物，在中国局部分布于黑龙江、江苏、河北和青海，主要寄主为马铃薯、番茄和鳄梨，还能感染其它植物，包括辣椒、甘薯、茄、茄属观赏植物、龙葵、曼陀罗属、素馨茄、灯笼果、人参果、矮牵牛属植物等。类病毒是无蛋白质外壳保护的游离的共价闭合环状单链RNA分子，侵入宿主细胞后自我复制，具有高度的侵染活性，50～100分子的类病毒可以引起成功的侵染，并使宿主致病或死亡。凤果花叶病毒（Pepino mosaic virus，PepMV）为马铃薯X病毒(Potexvirus)属病毒，最初发现于凤果（又称人参果、香瓜茄）上，可侵染番茄、茄子、烟草和马铃薯等茄科作物及苋属杂草、小花锦葵、粉蓝烟草、龙葵、罗勒和苦苣菜。番茄受侵染后叶部出现黄斑，叶脉轻微枯萎，有时畸形，果实表面通常有斑点，植物矮小并扭曲。PepMV主要分布在秘鲁、荷兰和英国，对欧洲及美洲的番茄生产造成了毁灭性影响，被欧洲及地中海植物保护组织（EPPO）列于警戒目录，我国尚无分布情况的报道。烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）为豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)的成员，可侵染番茄等54科246种草本和木本植物，在植物上引起环斑等症状，是我国进境植物检疫性有害生物。该病毒通过线虫、机械接种和种子等途径传播，在多种多年生植物及种子上越冬，成为来年的初侵染来源，种子传播是TRSV远距离传播的主要途径。PSTVd、PepMV和TRSV均可侵染番茄，具有寄主范围广泛、可通过种子传播、传播途径多样的特点，一旦随生产性引种传入、扩散和蔓延，将对番茄生产构成严重障碍，对我国的生态安全、农业生产的正常发展造成严重影响。

目前番茄病毒病和类病毒病的主要检测方法有生物学测定、血清学测定、电子显微镜技术和分子生物学技术。生物学测定方法的鉴别寄主法简单易行，反应灵敏，但工作量比较大，常常受温室条件和时间的限制，加之症状反应常受环境、土壤和气候条件的影响，在一定程度上制约了鉴别寄主方法的应用。采用ELISA方法检测植物病毒，操作过程简便、快捷，但由于交叉反应等问题，可能出现假阳性。利用电子显微镜检测病毒，可直接观察病毒的大小、形态，但存在设备昂贵，技术要求高，准确性和灵敏度较低的弱点。对PSTVd而言，其侵染植物隐症现象比较普遍，症状表现受环境温度的影响较大，有的鉴别植物对不同类病毒的反应症状相似，所以难于应用生物学方法进行诊断；类病毒不产生蛋白质，无法使用血清学方法检测。分子生物学技术与血清学方法相比较，不需要制备抗体，检测所需的病毒量少，具有灵敏、快速、特异性强等优点，已成功地用于各种病毒的快速检测。由于常规PCR技术一次只能扩增一个模板，如果反应体系中含有两种以上的病原物，则需进行多次PCR，不但操作复杂，而且费用高，耽误时间。多重PCR方法使用多对引物，可在一个反应中扩增多种靶序列，其优点是可以在一种样品中同时鉴别多种病毒，并将PCR的敏感性和快速性结合起来，避免了逐一扩增待测样品中每种病原的麻烦，可提高诊断的敏感性，同时降低检测费用。

目前PSTVd、PepMV和TRSV已建立单一RT-PCR分子检测技术，但尚未见这3种重要种传病原的多重PCR检测方法的报道。建立稳定灵敏的多重PCR技术，可实现在同一反应管中同时对PSTVd、PepMV和TRSV三种病原进行鉴别检测，提高检测准确性，缩短检测周期，降低检测成本，降低病原物种传的危险性，为农业生产安全和制种业发展提供技术保障。

发明内容

本发明的目的提供一种番茄种传病原多重PCR检测试剂盒，番茄种传病原为马铃薯纺锤块茎类病毒、凤果花叶病毒或烟草环斑病毒。

本发明的又一目的提供一种番茄种传病原多重PCR检测方法。番茄3种重要种传病原的多重PCR检测方法，它是在PSTVd、TRSV和PepMV单一RT-PCR检测体系的基础上，建立能同时检测这三种病原的多重PCR检测方法，适合田间样品和种子的测定。