[发明专利]去除邻硝基苯甲醛的酶制剂及应用

说明书

技术领域

本发明属于酶基因工程及酶工程领域，涉及一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂及应用。

背景技术

随着我国工业化进程的加快，有机工业合成废水的排放量越来越大。有机工业合成废水是指在生产过程中排放的含有对生物体有毒的工业废水，这类废水不仅含大量有机物，且存在大量对生物体有毒害作用的物质，已对环境造成了严重的污染，威胁到人类生命健康。参照急性毒性分级标准，邻硝基苯甲醛(o-nitrobenzaldehyde，ONBA)为中等毒性化合物。ONBA是重要的精细有机化工中间体，广泛用于医药、染料和有机合成，如用于合成抗心绞痛药物硝基吡啶(心痛定)、邻硝基苯乙烯类及邻硝基肉桂酸类系列产品等。将其硝基还原成氨基后，所得到的邻氨基苯甲醛还可用于喹啉类化合物的合成，其工业需求量十分大。但由于其生产过程伴随着大量污染物质的产生，发达国家已将其生产线转移到发展中国家(污染转移)，这一点在我国东南部地区尤为明显。具不完全统计，东南地区年产邻硝基苯甲醛在70万吨以上，且绝大多数生产废水未经处理就直接排放，对周边环境造成了极大的损害。在一定程度上，可以说这一点源污染已成为面源污染。

硝基芳香化合物的去除主要有物理法、化学法和微生物降解法三种。物理和化学方法虽然能够有效去除此类物质，但成本高，需要特制的仪器和装备，且酸、碱易腐蚀，具有一定的危险性。实际上，硝基芳香化合物在环境中的降解和转化主要是由微生物完成的(微生物对其的代谢多通过一系列酶促反应完成)。因此，如何充分利用好功能微生物资源，去除特异性污染物，成为了修复相关环境的迫切需要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂。

本发明的另一目的是提供该酶制剂的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂，其特征在于：所述的酶制剂为水溶液或缓冲溶液，包含一种邻硝基苯甲醛降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，以及终浓度为0.1-0.3mM的CaCl₂，反应体系pH值为6.5-8.0。酶制剂为缓冲溶液时，该缓冲溶液一般为pH值7.2-7.7的50-100mM磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液。所述的邻硝基苯甲醛降解酶的纯酶含量为0.03-0.1mg/mL。进一步的，所述的CaCl₂终浓度为0.2mM。

一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂的制备方法，其特征在于：取纯化酶液样本20mL和氯化钙，用pH值7.5的80mM磷酸钠缓冲液定容至1L制成酶制剂，酶制剂中氯化钙的终浓度为0.1-0.3mM。

所述纯化酶液样本的制备方法如下：所述纯化酶液样本的制备方法如下：挑取含有重组质粒的菌株，该重组质粒上含有nbaA基因编码片段，用LB培养基于37℃培养，待A_600nm值为0.6时，加入IPTG至终浓度1mM，随后于20℃过夜表达；离心收集细胞，重悬于80mM pH7.5的磷酸钠缓冲液，在冰水浴中超声破碎细胞——功率为400W超声波破碎5s，暂停15s，共进行60个循环；随后，于4℃，10000g离心30min去除细胞碎片，上清液即为粗酶提取液；使用一站式组氨酸标签蛋白纯化试剂盒对所述粗酶提取液进行纯化，获得纯化酶液样本。

所述的酶制剂在降解土壤中邻硝基苯甲醛中的应用。应用所述酶制剂降解土壤中邻硝基苯甲醛时，体系温度为18-40℃，pH为6.0-8.5。

本发明通过克隆Pseudomonas sp.ONBA-17中负责ONBA降解的脱氢酶基因并表达，获得了ONBA降解酶，为ONBA的降解提供有效的生物降解手段，对于ONBA污染环境的修复具有重要意义。该菌是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的菌株ONBA-17，于2013年9月2曰在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No.8095。保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，该菌的分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.。

本发明采用的NbaA酶对ONBA的酶活力为2442U/mg，分别是NahF酶活力(552U/mg)和NahV酶活力(245U/mg)的442.4％和996.7％，显著强于二者。而nbaA同nahF和nahV的序列同源性分别为62％和89％。由上可知，基因序列的不同引发了酶的空间构象的差异，并最终致使酶作用能力产生差异。