[发明专利]利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法

权利要求书

1.一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法，其特征在于选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) F69作为β-半乳糖苷酶的生产菌种，先经摇瓶震荡法发酵制备发酵液或者发酵罐通风发酵法制备发酵液、再经β-半乳糖苷酶酶制剂制备，而得到β-半乳糖苷酶酶制剂成品，具体步骤如下：

所述的摇瓶震荡法发酵制备发酵液：包括⑴菌种活化、⑵种子液制备和⑶摇瓶液体发酵；

所述的发酵罐通风发酵法制备发酵液：包括⑴菌种活化、⑵一级种子液制备、⑶二级种子液制备和⑷发酵罐气升式发酵；

所述的β-半乳糖苷酶酶制剂制备：包括⑴发酵液分段超滤、⑵发酵液硫酸铵盐析、⑶透析、⑷超滤浓缩、⑸添加保护剂、⑹粗酶冷冻干燥和⑺固体粗酶粉碎。

2.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法，其特征在于所述的摇瓶震荡法发酵制备发酵液：包括⑴菌种活化、⑵种子液制备和⑶摇瓶液体发酵，其中：

⑴菌种活化：将保藏号为CGMCC No.5699的枯草芽孢杆菌菌种F69在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线活化，然后倒置于40-42℃恒温培养箱中进行活化培养，培养时间15-24h；其中：

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、琼脂粉1.5g和蒸馏水100mL，培养条件pH6.5-6.8、灭菌温度121℃、灭菌时间20min；

⑵种子液制备：从⑴的活化好的菌种中挑取单菌落，接入装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，培养温度40-42℃、摇床震荡培养18-24h，震荡频率160-200r/min；其中：

种子培养基：乳糖0.5-1g、蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl 0.5g、K₂HPO₄ 0.02g，加蒸馏水至100ml，培养条件pH6.5-6.8、灭菌温度121℃、灭菌时间20min；

⑶摇瓶液体发酵：将⑵中的种子液，以4-8%的接种量接入装有150-200ml摇瓶发酵培养基的1000mL三角瓶中，三角瓶塞采用乳胶塞，发酵温度40-42℃，摇床发酵18-24h，摇床转速160-200r/min；然后将发酵温度降至35-37℃，继续震荡发酵培养，发酵时间40-48h； 

摇瓶发酵培养基：豆饼粉10-15g、玉米浆15g、乳糖5-10g、葡萄糖3-4g、硫酸铵3-5g、牛肉膏2-5g、NaCl 2-5g、KH₂PO₄ 0. 1g、MgSO₄?7H₂O 0.04g、CaCl₂ 0.2-0.5g、吐温80 2g和蒸馏水1000mL，培养条件pH6.5-6.8、灭菌温度121℃、灭菌时间20min。