[发明专利]利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法。

 

背景技术

β-半乳糖苷酶（EC3.2.1.23），又称乳糖酶，广泛存在于各种动物、植物及微生物中，其来源十分丰富。其中细菌中的乳酸菌、环状芽抱杆菌、大肠杆菌、产气肠细菌等；霉菌中的米曲霉、黑曲霉、炭色曲霉等；酵母中的脆壁克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母等；放线菌中的天蓝色链霉菌等均产β-半乳糖苷酶。由于微生物的快速生长和高效代谢的生物学特性，使其成为工业化酶制剂的主要来源。β-半乳糖苷酶在乳品工业中具有重要用途：第一，它能够水解牛乳和其他乳制品中的乳糖，消除人们在饮用乳制品时出现的乳糖消化吸收差，以致产生腹胀、腹泻等乳糖不耐症现象；第二，有效解决液态牛奶在超高温瞬时杀菌时，牛乳中乳糖的存在会导致胶状物的产生以致堵塞管道的问题；第三，β-半乳糖苷酶的转糖苷活力还可将乳糖水解生成的半乳糖转移给果糖受体生成乳果糖，即目前颇受关注的功能性低聚糖，促进双歧杆菌增殖，调整肠道菌群平衡，增强机体免疫作用；同时乳糖经乳糖酶水解生成其组分单糖-葡萄糖和半乳糖，不仅大大改善了其加工性能，而且甜度提高，发酵性能好，更易被小肠消化吸收，提高人体免疫力。

目前β-半乳糖苷酶已经从多种细菌、真菌中分离到，但应用于生产中的β-半乳糖苷酶耐热性较差，仅能在常温下工作，而且水解反应速度较慢，所需时间较长，鲜奶容易受到细菌污染而发生变质，极大限制了它的应用范围。耐热β-半乳糖苷酶与不耐热的相比有众多优势，它可能在巴氏消毒温度水解乳糖，温度高水解速度快，所需时间短，需要酶量减少，同时乳糖的水解过程也是巴氏消毒过程，防止杂菌污染。因此，如何克服现有技术的不足，加快研发耐热性好的β-半乳糖苷酶产品已成为当今生物工程技术领域中亟待解决的重点难题之一。

 

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的不足而提供一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法，本发明生产的β-半乳糖苷酶不仅耐热性好，而且β-半乳糖苷酶的回收率高，可大大降低生产成本，从而实现大规模生产耐热性β-半乳糖苷酶的目的。

根据本发明提出的一种利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备β-半乳糖苷酶酶制剂的方法，其特征在于选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) F69作为β-半乳糖苷酶的生产菌种，先经摇瓶震荡法发酵制备发酵液或者发酵罐通风发酵法制备发酵液、再经β-半乳糖苷酶酶制剂制备，而得到β-半乳糖苷酶酶制剂成品，具体步骤如下：

所述的摇瓶震荡法发酵制备发酵液：包括⑴菌种活化、⑵种子液制备和⑶摇瓶液体发酵；

所述的发酵罐通风发酵法制备发酵液：包括⑴菌种活化、⑵一级种子液制备、⑶二级种子液制备和⑷发酵罐气升式发酵；

所述的β-半乳糖苷酶酶制剂制备：包括⑴发酵液分段超滤、⑵发酵液硫酸铵盐析、⑶透析、⑷超滤浓缩、⑸添加保护剂、⑹粗酶冷冻干燥和⑺固体粗酶粉碎。

本发明选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) F69作为β-半乳糖苷酶的生产菌种，该菌种于2012年1月 9日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号CGMCC No.5699。目前，枯草芽孢杆菌已被广泛用来生产功能性食品和饲用微生态制剂，是食品、饲料中允许使用的微生物，具有极高的安全性，是一种潜在的益生菌。

本发明与现有技术相比其显著优点在于: 一是本发明生产的β-半乳糖苷酶耐热性好，即80℃保温60min、残余酶活达85％；酶活性高，即发酵液酶活达216U/ml；酶回收率高，即总酶活回收率大于80%、酶冻干粉酶活力单位达到2512U/g；二是本发明以豆饼粉、蛋白胨和玉米浆为主要原料，生产成本低；三是酶制剂制备过程采用离心、超滤、硫酸铵盐析、透析和冷冻干燥等步骤，成品杂质含量低，达到食品添加剂标准的要求；四是生产过程无废固物处理问题，对环境不造成污染；五是操作工艺简单、生产效率高和生产成本低，适合于大批量生产。

 

附图说明：

图1 是本发明提出的以一种枯草芽孢杆菌为菌种，经由摇瓶震荡法发酵制备发酵液，再制备β-半乳糖苷酶酶制剂的工艺流程方框示意图。

图2是本发明提出的以一种枯草芽孢杆菌为菌种，经由发酵罐通风发酵法发酵制备发酵液，再制备β-半乳糖苷酶酶制剂的工艺流程方框示意图。

 

具体实施方式