[发明专利]用于定性、定量检测枣疯病植原体的引物、探针及其方法

权利要求书

1.一种用于枣疯病植原体定性、定量检测的引物、探针，其特征在于，含有一条特异性循环探针和一对引物，所述引物对和探针的寡聚核昔酸序列为： 

上游引物JWB Primer-F：5’-TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3’ 

下游引物JWB Primer-R：5’-CTCCCGTAGGAGTTTGG-3’ 

探针JWB-Probe：5’-AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-3’。 

2.如权利要求1所述用于枣疯病植原体定性、定量检测的引物、探针，其特征在于，其设计方法是：从NCBI中搜集全部植原体及有代表性细菌的16S rDNA核酸序列，利用Omiga软件对上述序列进行比较及一致性分析，找出枣疯病植原体与其他植原体的基因差异位点，用软件Beacon Designer7.0筛选出一对特异性的PCR引物，在该引物对的扩增区域设定一条荧光Tapman探针，并利用NCBI中的Blast程序分别对上游引物、下游引物和探针进行比对，确保枣疯病植原体特异性的引物和探针设计区域为枣疯病植原体所特有，从而保证扩增产物的特异性。 

3.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对扩增位于枣疯病植原体16S rDNA基因202bp～299bp位点的片段，扩增片段大小为98bp。 

4.如权利要求1所述的用于枣疯病植原体定性、定量检测的探针，其特征在于，该探针的5’端具有报告荧光染料FAM标记，3’端具有淬灭荧光染料TAMRA标记。 

5.一种用于枣疯病植原体定性、定量检测的方法，该方法包括下列步骤： 

(1)采用植物基因组提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)提取枣树叶片总DNA，置于-40℃冰箱贮存备用。 

(2)以提取的植物总DNA为模板，分别设阳性对照、健康植株总DNA对照及无菌双蒸水对照，采用JWB-Probe探针及JWB Primer引物对进行实时荧光定量PCR检测。 

(3)根据各样本的反应Ct值，按照枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测结果的阳性判定标准判定待检样本中是否存在枣疯病植原体，即可实现枣疯病植原体的定性检测；并可通过预先建立的荧光定量PCR反应的标准曲线方程计算出检测样品中枣疯病植原体16S rDNA基因片段拷贝浓度，据此得到样品中枣疯病植原体的数量，从而实现定量检测。 

6.如权利要求5所述的一种用于枣疯病植原体定性、定量检测的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR检测的反应体系为20μL：包括2.5×realMasterMix8.0μL，20×Probe Enhancer solution1.0μL，10μmol/L的上游引物JWB Primer-F0.5μL、10μmol/L的下游引物JWB Primer-R0.5μL，10μmol/L的TaqMan探针JWB-Probe0.5μL，模板DNA1.0μL，补足灭菌ddH₂O至20μL。 

7.如权利要求5所述的一种用于枣疯病植原体定性、定量检测的方法，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃预变性2mmin；以95℃变性15s，60℃退火30s，68℃延伸1min进行40个循环，68℃设置FAM荧光通道采集荧光。 

8.如权利要求5所述的一种用于枣疯病植原体定性、定量检测的方法，其特征在于，所述的枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测结果的阳性判定标准为：如果样品荧光PCR扩增曲线的Ct值≤34，而且同时阴性对照及空白对照无扩增曲线，则判定待检样品中含有枣疯病植原体，否则该样本不含枣疯病植原体。 

9.如权利要求5所述，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的标准曲线方程为：y＝-3.354x+38.27，x为所测样品中枣疯病植原体16S rDNA基因片段拷贝数的对数，y为Ct值。