[发明专利]用于定性、定量检测枣疯病植原体的引物、探针及其方法

说明书

技术领域

本发明属于植物检疫技术领域，涉及用于对枣疯病植原体进行定性、定量检测的引物、探针及其检测方法，特别是涉及用实时荧光定量PCR技术对枣疯病植原体进行定性、定量检测的引物、探针及其方法。

背景技术

枣疯病(Jujube witches’broom，JWB)又称“枣癌症”是由植原体病原侵染导致的、在枣树生产中危害最严重的毁灭性病害。植原体原称类菌原体，为单细胞原核生物，无细胞壁，由生物膜包围，可引起多种病害。根据植原体16S rDNA基因序列为对象进行分析，可将植原体分为28个组。其中引起枣疯病的枣疯病植原体与榆树黄化植原体、葡萄金黄化植原体等同为植原体榆树黄化组成员。枣疯病分布范围广，传播速度快，致病力强，树体一旦感病，终身携带，传统的病害防治技术和栽培技术难以治愈。我国多数枣树主栽品种对枣疯病敏感，全国每年因枣疯病死树高达千万株，直接经济损失高达数亿元，严重阻碍了枣树产业的发展。要从根本上解决枣疯病的防治问题是采取有效的预防措施，加强种苗(接穗、砧木)的检疫检验，采用健康苗木(砧木、接穗)，建立无病苗木繁育体系，从源头上杜绝病原才是控制枣疯病发生蔓延的根本途径，而建立和应用先进的病原检测技术是红枣无病苗木生产的核心所在。

植原体自发现后的10多年里，其检测技术的发展一直没有大的突破。传统的电镜观察、血清学等检测方法因为灵敏度低、周期长和操作繁琐等不足，已不能满足现代生产的需要。随着分子生物学技术引入植原体病害研究领域，植原体鉴定和检测技术才得到了较快的发展，如普通PCR、巢氏PCR等技术的应用使植原体检测灵敏度和鉴定水平有了极大的提高，但这些方法整个过程繁杂，操作步骤多，而且需要PCR后处理，如琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，如果要鉴定到种或组，还要进行限制性内切酶多态性分析(RFLP)，或者进行核酸序列测定和同源性比较，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会，严重影响对结果的正确判断。为此研发一套简单、快速、灵敏、准确的枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测方法，以期满足检疫工作的需要。

荧光PCR(FQ-PCR)技术是美国珀金埃尔默公司(PerkinElmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该方法自产生以来，不断发展完善，其中TaqMan探针实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中添加了一对引物的同时加入了一条标记了2个荧光基团的特异性TaqMan探针，在PCR扩增过程中TaqMan探针同PCR产物杂交，引起报告基团发出荧光信号，通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板进行定性及定量分析。与常规PCR检测方法相比，该法具有特异性强、耗时短、灵敏度高、稳定性好和定量等优点。

目前国内已建立了用于检测植原体榆树黄化组成员的实时荧光PCR检测方法，但该方法仅能实现植原体组间的特异性检测，无法对植原体榆树黄化组内的植原体进行区分和鉴定。本发明在对植原体大量基因信息进行分析比较的基础上，建立了枣疯病植原体特异性的实时荧光定量PCR检测方法，能较好的区分不同组间及组内的植原体，可大大提高枣疯病植原体的检测效率，从而满足我国相关检疫工作的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于对枣疯病植原体进行定性、定量检测的引物、探针及其检测方法，具有快速定性和定量检测枣疯病植原体的功能。本发明操作简单，易于掌握，检测精度高，可广泛应用于实验室等日常检测工作。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是。

(1)设计并提供用于枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测的引物和探针。

引物的序列为：

上游引物JWB Primer-F：5’-TGGTGAGGTAAAGGCTTA-3’；

下游引物JWB Primer-R：5’-CTCCCGTAGGAGTTTGG-3’。

探针的序列为：

JWB-Probe：5’-FAM-AATGTGGCTGTTCAACCTCTCA-TAMRA-3’。

(2)提供枣疯病植原体实时荧光定量PCR检测方法，即首先从待检测枣疯病样品中制备反应模板，并建立和优化实时荧光定量PCR反应体系，然后通过设定实时荧光PCR反应程序，利用荧光PCR仪对反应模板进行扩增和荧光收集。

(3)最后根据仪器给出每个样品的Ct值，分析检测结果。