[发明专利]一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法

权利要求书

1.一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株F69的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年1月9日，保藏编号为：CGMCC No.5699。

2.根据权利要求1所述的一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株F69（CGMCC No.5699）具有以下特性：

(1) 生长条件：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）F69所产β-半乳糖苷酶的生长温度55～75℃，最适生长温度65℃；

(2) 酶活性：在50℃～80℃下保温90min，残余酶活在80％以上，在80℃和90℃下保温60min，残余酶活分别为85％和65％； 

(3) 弱酸性：在pH5.5～7.5之间酶活性在80%以上，在pH 4.5～7.5之间保持81%以上的酶活性，最适作用pH为6.5。

3.基于权利要求1所述的一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于依次包括如下具体步骤：

步骤一，富集培养：取土样1g研细，加入装有80ml 无菌水的250ml 三角瓶中，加入无菌玻璃珠，在150r/min摇床中振荡20min，然后在80℃震荡水浴摇床中震荡30 min，取1 -2 ml于50 mL富集培养基中，40℃恒温水浴振荡培养36h-48h，震荡频率为150-180r/min；

步骤二，初筛：将富集后的培养液进行10倍梯度稀释至稀释倍数为10^-8，分别取10^-6、10^-7、10^-8三个梯度的稀释液0.2ml涂布在初筛分离培养基平板上，平板晾至表面没有流动液体时，在40～42℃恒温培养箱中倒置培养24～36h，然后将培养温度降到32～35℃，继续培养24～72h；挑取蓝色菌落至另一个初筛分离培养基上，培养条件为：温度40～42℃，培养时间30～36h；经培养后菌落呈现深浅不一的蓝色，进一步选取蓝色较深的菌株划线纯化；

步骤三，菌株纯化：将初筛出来的菌株，于牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，置于40～42℃恒温培养箱中培养48h，重复划线培养三次以上，如连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化；

步骤四，复筛：初筛后将经过纯化的菌株接种到种子培养基中，容量为250ml的三角瓶装液量为30ml，在温度为40～45℃，震荡频率为160～180r/min下，恒温震荡摇床培养18-22h，然后按照4～6%的接种量接种到复筛发酵培养基中，摇床震荡发酵培养，发酵条件为：在250ml三角瓶中装培养基30～50ml，摇床震荡频率为160-200r/min，发酵温度40～45℃，发酵时间为36～48h，发酵结束后，发酵液8000r/min离心10min，上清液为粗酶液，测定各粗酶液的β-半乳糖苷酶酶活性，其中菌株F69产β-半乳糖苷酶活性最强，活力高达182U/ml；

步骤五，菌种保藏：将复筛得到的菌种在斜面培养基上划线，40～45℃培养3天，然后置于4℃冰箱保存；

步骤六，β-半乳糖苷酶酶活性测定：取500 μL待测酶液加入到已经预热到65℃的1.5 mL含有2 mmol/L ONPG的0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）中，65℃水浴保温10 min后，加入1mL 1mol/L的碳酸钠溶液终止反应，A₄₀₅测定光吸收值，计算水解产物邻硝基酚的含量和酶的活性，同时以0.1 mol/L pH 6.5磷酸酸缓冲液代替酶液作为对照，乳糖酶活性的定义：1个单位的乳糖酶的活性为在pH 6.5、65℃下每分钟分解ONPG生成l μmol邻硝基酚(ONP)所需的酶量。

4.根据权利要求3所述的一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于步骤一所述的富集培养基为：乳糖2g、酵母粉0.5g、蛋白胨1g、NaCl 0.5g和蒸馏水100ml，条件：pH 6.5、灭菌温度121℃、灭菌时间20 min。