[发明专利]一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法

说明书

  

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一种产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法。 

  

背景技术

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC3.2.1.23)，学名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，商品名为乳糖酶，能够催化β-D-半乳吡喃糖苷水解或者转糖基化，常用于水解牛乳和其它乳制品中的乳糖，也可用来生成低聚半乳糖，广泛适用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产，解决世界一半以上人口存在的乳糖不耐症问题，β-半乳糖苷酶还具有半乳糖苷转移作用，用于生产双歧因子-低聚半乳糖，从而在益生菌食品生产中广泛应用。β-半乳糖苷酶在食品中的重要应用价值引起人们对它的广泛关注。β-半乳糖苷酶主要来源于动物、植物、细菌、酵母、真菌或霉菌。由于微生物的快速生长、高效代谢以及分离纯化相对简单等优势，使微生物β-半乳糖苷酶成为工业化酶制剂的主要来源。目前乳品工业用于分解乳糖的β-半乳糖苷酶多从酵母、曲霉菌或乳酸菌中经诱导产酶后提取获得，但是均存在热稳定性差的缺点，严重限制了它在乳制品中的应用。 

如果采用耐高温β-半乳糖苷酶将可克服热稳定性差的缺陷，酶在60℃以上温度水解乳糖，可以有助于抑制杂菌微生物的生长。而且酶反应速度快，酶用量低，反应时间短，生产中可与巴氏杀菌同时进行或冷却阶段保温水解，即在巴斯德消毒过程中同时进行乳糖水解，省时、省工且能防止杂菌污染。尽管目前诸多文献报道了筛选分离多种β-半乳糖苷酶菌株，如酵母菌、乳酸菌属、芽孢杆菌属、曲霉菌属等系列菌株的方案，但目前生产所用的β-半乳糖苷酶大多最适作用温度在30℃左右，在高温下的酶活力都很低，且成本高，难以满足市场及生产所需。如何克服现有技术的不足，加快研发耐高温的β-半乳糖苷酶产品已成为当今生物工程技术领域中亟待解决的重点难题之一。 

  

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的不足而提供一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法，该菌株产β-半乳糖苷酶发酵周期短、产β-半乳糖苷酶速度快、遗传稳定性好、pH稳定性好和催化活力强，且培养条件简便和生产安全性高。 

根据本发明提出的一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株F69的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年1月9日，保藏编号为：CGMCC No.5699，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

本发明所述的菌株F69（CGMCC No.5699）具有以下特性： 

(1) 生长条件：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）F69所产β-半乳糖苷酶的生长温度55～75℃，最适生长温度65℃；所测β-半乳糖苷酶活力都在90%以上，表明该酶在较高的温度范围内催化活性很高，温度适应性强；

(2) 酶活性：在50℃～80℃下保温90min，残余酶活在80％以上，在80℃和90℃下保温60min，残余酶活分别为85％和65％；表明枯草芽孢杆菌F69所产β-半乳糖苷酶具有很强的热稳定性；

(3) 弱酸性：在pH5.5～7.5之间酶活性在80%以上；在pH 4.5～7.5之间保持81%以上的酶活性，最适作用pH为6.5；表明β-半乳糖苷酶在弱酸性及中性环境下非常稳定。

根据本发明提出的一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于依次包括如下具体步骤： 

步骤一，富集培养：取土样1g研细，加入装有80ml 无菌水的250ml 三角瓶中，加入无菌玻璃珠，在150r/min摇床中振荡20min，然后在80℃震荡水浴摇床中震荡30 min，取1 -2 ml于50 mL富集培养基中，40℃恒温水浴振荡培养36h-48h，震荡频率为150-180r/min；