[发明专利]一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途

权利要求书

1.一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基，其特征在于，其关键组组分为碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子-AA和神经营养因子3。

2.根据权利要求1所述的一种诱导神经干／祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基，由基础培养基及添加物构成，其特征在于：

所述基础培养基采用商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium任一一种；

所述DF medium培养基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3)：1，HEPES浓度为10-20mmol／L，D-葡萄糖浓度为质量／体积比1-2g/ml；

所述添加物包括：B27、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、肝素、乳酸钠、碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子-AA及神经营养因子3，其中，B27为1×，转铁蛋白浓度为5-20μg／ml，孕酮浓度为5-20nmol／L，腐胺浓度为20-40μmol／L，亚硒酸钠浓度为10-20nmol／L，胰岛素浓度为5-20μg／ml，肝素浓度为2-10μg／ml，乳酸钠浓度为3-10mmol／L，碱性成纤维生长因子浓度为5-30ng／ml，血小板源性生长因子-AA浓度为5-30ng／ml，神经营养因子3浓度为5-30ng/ml。

3.根据权利要求2所述的一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基，其特征在于：所述添加物还包括浓度为100U／ml的青链霉素。

4.一种高效率诱导神经干／祖细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，将人神经干／祖细胞经过预处理培养基预处理培养一定时间后，在诱导培养基的作用下，迅速分化为高纯度表达O4、A2B5、NG2等少突胶质前体细胞标志物的少突胶质前体细胞，所述诱导培养基的关键成份为碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子-AA和神经营养因子3。

5.根据权利要求4所述的一种高效率诱导神经干／祖细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)将人神经干／祖细胞分散为单个细胞悬液；

2)细胞洗涤后重悬于预处理培养基中，调整密度为2～10×10⁵／ml；

3)将细胞悬液接种于细胞培养瓶中，在5-8.5％CO₂、37℃和饱和湿度的培养条件下进行培养；

4)之后每3～5天进行一次半量换液，至细胞连续培养7-12天；

5)将细胞收集到的离心管中，400g离心5分钟沉淀细胞；

6)弃上清，采用质量体积百分比为0.025％的胰酶消化细胞球，使细胞消化为单细胞悬液，消化约10分钟后，用浓度为1mg／ml的胰酶抑制剂终止消化；

7)400g离心5分钟收集细胞；

8)弃上清，用OPCs诱导培养基重悬细胞，调整密度为2～10×10⁵／ml；

9)将细胞悬液接种于细胞培养瓶；

10)诱导4-10天后，可见细胞培养瓶底出现大量贴壁的OPCs。

6.根据权利要求4-5任意一项所述的一种高效率诱导神经干／祖细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述预处理培养基由基础培养基和添加物构成，所述基础培养基采用商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium任一一种；

所述DF medium培养基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3)：1，HEPES浓度为10-20mmol／L，D-葡萄糖浓度为质量／体积比1-2g／ml；

所述添加物成分包括B27、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、白细胞抑制因子、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素和肝素，其中，B27为1×，表皮生长因子浓度15-25ng／ml，碱性成纤维细胞生长因子浓度10-20ng／ml，白血病抑制因子浓度7-13ng／ml，转铁蛋白浓度50-150μg／ml，孕酮10-30mmol／L，腐胺50-150μmol／L，硒酸钠20-40mmol／L，胰岛素10-50μg／ml，肝素3-10μg／ml。