[发明专利]一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学、神经生物学领域，特别是涉及一种诱导神经干／祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途。

背景技术

各种各样的髓鞘相关疾病，如脑白质损伤、脊髓损伤、多发性硬化等疾病由于神经元的髓鞘化障碍或脱髓鞘化，导致了神经元不能正常传递电兴奋，从而导致机体运动等功能失能，给这些疾病的患者及家庭带来了极大的伤害，但是目前还没有任何一种药物可以有效地治疗这些髓鞘相关疾病。

不论是髓鞘化障碍还是脱髓鞘病变，其根源都是神经元轴突髓鞘程度减少或丢失，因此如果能够恢复神经元轴突的髓鞘化程度，使得神经元电流得以稳定快速地传导，理论上这些疾病就可以被治愈。研究发现，少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells，OPCs)是负责中枢神经系统髓鞘化的关键细胞，在中枢神经系统中，OPCs可以分化为少突胶质细胞(oligodendrocyte，OL)，OL进一步包绕神经元轴突形成完整的髓鞘结构，从而保证神经元电流的稳定快速传导。髓鞘相关的疾病一方面是因为疾病破坏了已经形成的髓鞘结构，另一方面更是由于神经系统中OPCs受到了损伤，使得OL失去了源泉，因此难以髓鞘再生。动物实验研究发现，向先天性髓鞘化形成障碍的shiver小鼠或脑白质损伤大鼠移植OPCs时，移植的OPCs可以在体内正常包绕神经元轴突形成髓鞘使得这些动物的神经功能恢复，表明OPCs移植可能是治疗髓鞘损伤疾病的一个新的方向。

尽管啮齿类动物的OPCs很容易获得，人OPCs获得却相当困难，通过种种细胞分离技术尽管可以分离得到OPCs，但是数量相当有限，距离临床应用还非常遥远。干细胞的研究为OPCs获得提供了新的思路，干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞及各种成体干细胞，胚胎干细胞可以分化为机体的任何一种细胞，而成体干细胞则通常只能分化为其谱系决定的细胞。美国的Hans等人研究发现，胚胎干细胞体外可以分化为OPCs，且OPCs移植有助于脊髓损伤的神经功能恢复，该方法在美国进入了临床I期的治疗研究。但胚胎干细胞的全能性是把双刃剑，既能分化为各种细胞，也有致瘤的风险，因此此方法获得的OPCs在临床上应用还存在一定的致瘤风险。成体干细胞由于分化能力受到限制，在一定程度上避免了致瘤的风险，临床应用上更为安全。神经干／祖细胞(neural stem／progenitor cells，NS／PCs)就是一种成体干细胞，它来源于神经组织或者胚胎干细胞分化，从发育学上看NS／PCs是OPCs的前体细胞，因此理论上最适合于OPCs的诱导。

干细胞所处的微环境同干细胞分化方向密不可分，NS／PCs同样如此。NS／PCs在体外呈悬浮培养形成球状结构，这些细胞并非完全均一，不同的预处理会使得这些细胞呈现出不同的分化能力。例如，表皮生长因子(EGF)预处理会增加星形胶质细胞分化的比例，而碱性成纤维生长因子(bFGF)预处理则能增强神经元分化的比例。

发明内容

鉴于以上缺陷，本发明通过长时间预处理和生长因子联合诱导，提供一种诱导神经干／祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途。

本发明中，我们首次发现一定浓度的EGF联合bFGF预处理人NS／PCs可以大大提高OPCs分化的比例，这些进一步证实了细胞外和细胞间的相互通讯是干细胞分化的关键决定因素。但是仅仅采用EGF联合bFGF预处理不足以将人NS／PCs直接分化为OPCs，还需要生长因子的进一步诱导作用才能获得大量的高纯度OPCs。本发明中我们发现采用三种生长因子：碱性成纤维生长因子(bFGF)、血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA)和神经营养因子3(NT-3)的组合足以诱导预处理后的NS／PCs向OPCs分化，且这三种因子缺一不可，否则将大大降低分化诱导的效率。

本发明提供的该种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基，其关键组份为碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子-AA和神经营养因子3。

更进一步的，本发明提供的该种诱导神经干／祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基，其由基础培养基及添加物构成，其中：

所述基础培养基可为商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium任一一种。

所述DF medium培养基组成：由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3)：1，HEPES浓度为10-20mmol／L，D-葡萄糖浓度为质量／体积比1-2g／ml。