[发明专利]一种用于肉毒杆菌LAMP核酸检测引物组和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子学和分类学领域，特别涉及用于肉毒杆菌LAMP核酸检测引物组和试剂盒。

背景技术

肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium.botulinum)是一种生长在缺氧环境下的革兰氏阳性产孢子细菌，具有极强的生存能力。肉毒杆菌产生的毒素，肉毒毒素是已知的毒性最强的毒素之一。肉毒杆菌是一种致命病菌，人们食入和吸收这种毒素后，神经系统将遭到破坏，病情严重可能导致死亡。目前报道新西兰恒天然浓缩乳清蛋白粉大批量被肉毒杆菌污染，多家产品被卷入其中。

传统肉毒杆菌检测技术为酶联免疫吸附剂测定(ELISA)，ELISA检测技术成本较低，但其受抗体批次和样本影响比较大，极易出现假阴和假阳性，其灵敏度和特异性无法满足检测需要。目前，肉毒杆菌的检测主要集中在荧光实时定量PCR方法。但是，荧光实时定量PCR方法需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，且操作复杂，检测耗时长，只有专业检测机构和实验室才能独立操作，不利于技术推广。

本发明所述用于肉毒杆菌LAMP核酸检测引物组和试剂盒与传统检验技术和荧光定量PCR技术产品相比灵敏度高、特异性好、仪器要求低、易于操作、适用于高通量筛选和污染易控制等独到的优势，市场前景广阔。

发明内容

本发明目的之一在于提供用于肉毒杆菌LAMP核酸检测的引物组。本发明的另一目的在于用于肉毒杆菌LAMP核酸检测的试剂盒。本发明的总体目的是将LAMP核酸检测与DNA显色检测相结合，开发出对仪器设备要求低，操作简单，适于基层人员操作的肉毒杆菌检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明公开了一种用于肉毒杆菌LAMP核酸检测引物组，其特征在于，包括：

外侧正向引物，其为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；

外侧反向引物，其为SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；

内侧正向茎环引物，其为SEQ ID No.3所示的多核苷酸序列；

内侧反向茎环引物，其为SEQ ID No.4所示的多核苷酸序列。

一种用于肉毒杆菌LAMP核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。

优选的是，包括含有权利要求1所述的引物组的反应体系，25μl所述反应体系的配置为：8U/μl的链置换DNA活性聚合酶，2μl浓度为10mM内侧正向茎环引物，2μl浓度为10mM的内侧反向茎环引物，0.5μl浓度为10mM外侧正向引物，0.5μl浓度为10mM外侧反向引物，2.5μl10×PCR缓冲液，1μl浓度为10mM的dNTPs，1μl浓度为1～10μg/μl的待检测基因组DNA提取液，1.25μl20×DNA荧光染料和13.25μl双蒸水。

优选的是，所述DNA荧光染料为10000×SYBR Green I。

优选的是，以待测肉毒杆菌DNA为模板作为检测组，以肺炎球菌DNA、大肠杆菌DNA、金黄色葡萄球菌DNA、鼠伤寒沙门氏菌DNA、破伤风梭菌DNA和白色念珠菌DNA做为阴性对照组，用权利要求2所述试剂盒配制所述反应体系进行LAMP检测，之后用紫外分析仪测量所述反应体系的荧光强度。

优选的是，与所述阴性对照组相比所述检测组荧光强度增强说明检测样品为肉毒杆菌。

优选的是，所述试剂盒的检测反应条件为：95℃预变性5min，65℃恒温反应1h和80℃孵育10min。

本发明人使用本发明所述引物组和试剂盒，按照本发明的检测方法对肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白色念珠菌(Candida albicans)等11种不携带NTNH基因的菌种进行LAMP核酸检测，反应结束以后用紫外分析仪进行不开盖荧光检测，结果显示阳性对照产生高强度DNA扩增荧光，而不携带NTNH基因的对照菌种不产生高于本底水平的荧光。从而证明对不携带NTNH基因的其他菌种的LAMP检测不会产生假阳性的结果。