[发明专利]一种利用黄鲫蛋白抗菌肽液热反应物分离前列腺癌PC-3抗癌肽的方法及其抗癌肽

权利要求书

1.一种利用黄鲫蛋白抗菌肽液热反应物分离前列腺癌PC-3抗癌肽的方法，其特征在于步骤为：

1）制备黄鲫蛋白抗菌肽液，调节黄鲫蛋白抗菌肽液的pH值至5.0～7.0；

2）对黄鲫蛋白抗菌肽液热处理，在100～121℃杀菌锅中加热30～60min，以制得抗癌型黄鲫蛋白抗菌肽液热反应产物；

3）从黄鲫蛋白抗菌肽液热反应产物中分离前列腺癌PC-3抗癌肽，上述黄鲫蛋白抗菌肽液热反应产物经Bio-Gel P-4凝胶色谱洗脱分离，上样量为柱体积的1～3%，以摩尔浓度20～200mM（含0.15～0.45mol/L NaCl）的磷酸盐缓冲液（pH值5.0～7.0）为洗脱剂，洗脱速度1.5～2.5mL/min，检测波长280nm，分别合并各个分离峰，旋转蒸发浓缩，冻干，测定各分离峰对前列腺癌PC-3肿瘤细胞的增殖抑制率，将Bio-Gel P-4凝胶色谱分离的抗癌活性最高峰用交联葡聚糖G25凝胶色谱进行二次分离，上样量为柱体积的1～3%，去离子水洗脱同时实现脱盐处理，洗脱速度0.5～2.5mL/min，检测波长280nm，收集分离图谱中各分离峰，旋转蒸发浓缩，冻干，分别测定各分离峰对前列腺癌PC-3肿瘤细胞的增殖抑制率，反复收集抗癌活性最高峰，经旋转蒸发浓缩，冻干，即得到所述抗癌肽粉。

2.根据权利要求1所述的利用黄鲫蛋白抗菌肽液热反应物分离前列腺癌PC-3抗癌肽的方法，其特征在于：所述步骤1）中黄鲫蛋白抗菌肽液的制备方法为:

a)先将去除内脏的黄鲫鱼洗净切块，用组织捣碎机搅碎均匀，制成鱼肉糜，按照鱼肉糜质量的3～4倍比例加入去离子水；

b)调节鱼肉糜与水混合液的pH值至1.5～3.0，并保持恒定；

c)再根据鱼肉糜的质量，胃蛋白酶以1000～1100U/g的比例加入到混合液中，在保持酶解温度35～37℃的条件下，酶解2～2.4小时；

d)加热，升温至90～100℃进行钝化灭酶，灭酶时间5～10分钟；

e)冷却至3～5℃以下，进行离心处理5～15分钟，离心速度6000～8000r/min；

f)过滤，取中间滤液至少在-20℃以下冻藏。

3.根据权利要求2所述的利用黄鲫蛋白抗菌肽液热反应物分离前列腺癌PC-3抗癌肽的方法，其特征在于：所述步骤c)中胃蛋白酶以1100U/g的比例加入到混合液中，在保持酶解温度37℃的条件下，酶解2.4小时。

4.根据权利要求1所述的利用黄鲫蛋白抗菌肽液热反应物分离前列腺癌PC-3抗癌肽的方法，其特征在于：所述步骤1）中调节黄鲫蛋白抗菌肽液的pH值至5.5。

5.根据权利要求1所述的利用黄鲫蛋白抗菌肽液热反应物分离前列腺癌PC-3抗癌肽的方法，其特征在于：所述步骤2）所述杀菌锅的温度为121℃，加热30min。

6.根据权利要求1所述的利用黄鲫蛋白抗菌肽液热反应物分离前列腺癌PC-3抗癌肽的方法，其特征在于：所述步骤3）中黄鲫蛋白抗菌肽液热反应产物经Bio-Gel P-4凝胶色谱洗脱分离，上样量为柱体积的1%～2%，所述磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为50mM含有0.15mol/L NaCl，pH值为5.8。

7.根据权利要求1所述的利用黄鲫蛋白抗菌肽液热反应物分离前列腺癌PC-3抗癌肽的方法，其特征在于：所述步骤3）中所述Bio-Gel P-4凝胶色谱分离的洗脱速度为1.5mL/min，所述经Bio-Gel P-4凝胶色谱分离得到的活性最高峰用交联葡聚糖G25凝胶色谱进行二次分离，上样量为柱体积的1%，所述交联葡聚糖G25凝胶色谱分离的洗脱速度为1.0mL/min。

8.根据权利要求1所述的利用黄鲫蛋白抗菌肽液热反应物分离前列腺癌PC-3抗癌肽的方法，其特征在于：所述步骤3）中所述抗癌肽粉经反相高效液相色谱分析确定纯度，所获得纯度为90～98%，ESI-MS/MS分析测定该抗肿瘤肽的分子量为500～700Da。

9.根据权利要求1所述的利用黄鲫蛋白抗菌肽液热反应物分离前列腺癌PC-3抗癌肽的方法，其特征在于：所述步骤3）中所述抗癌肽粉经反相高效液相色谱分析确定纯度，所获得纯度为94.06%，ESI-MS/MS分析测定该抗肿瘤肽的分子量为670.3518Da，即为所述抗癌肽粉。

10.一种利用如权利要求1所述的分离方法制得的前列腺癌PC-3抗癌肽，其特征在于：所述步骤3）中抗癌肽的氨基酸序列组成为Tyr-Ala-Leu-Pro-Ala-His。