[发明专利]一种携带人穿膜肽p53与GM-CSF基因的重组溶瘤腺病毒及其用途

权利要求书

1.一种重组溶瘤腺病毒载体，其可操作地插入或者包含下述外源基因：

穿膜肽编码序列、p53基因或其简并序列、2A连接序列，以及GM-CSF基因或其简并序列。

2.根据权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒载体，其中，所述穿膜肽编码序列、p53基因或其简并序列、2A连接序列、GM-CSF基因或其简并序列为依次连接。

3.根据权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒载体，其可操作地插入或者包含依次连接的下述外源基因：

组成型强启动子、穿膜肽编码序列、p53基因或其简并序列、2A连接序列、GM-CSF基因或其简并序列、SV40PolyA、第一绝缘子序列。

4.根据权利要求3所述的重组溶瘤腺病毒载体，其特征在于如下的（1）－（13）中的任一项或者多项：

（1）所述穿膜肽编码序列为编码聚精氨酸穿膜肽、单纯性疱疹病毒的VP22蛋白来源穿膜肽、降钙素来源穿膜肽或者艾滋病毒HIV Tat蛋白来源穿膜肽的序列；具体地，为编码11个精氨酸的序列；更具体地，其如SEQ ID NO：9所示；

（2）所述p53基因的序列如SEQ ID NO：10或者SEQ ID NO：11所示；

（3）所述连接序列如SEQ ID NO：7所示；

（4）所述GM-CSF基因如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示；

（5）所述穿膜肽编码序列和p53基因起始密码子之间连接有编码一个或多个甘氨酸的序列；具体地，为GGC；更具体地，穿膜肽编码序列和p53基因的序列如SEQ ID NO：4所示；

（6）所述组成型强启动子为CMV、CAG、SV40、EF-1α、Ubc或PGK启动子；优选为CMV或CAG启动子；具体地，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；具体地，所述CAG启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

（7）所述第一绝缘子序列如SEQ ID NO：1所示。

（8）所述外源基因可操作地连接或插入在腺病毒E1b区；

（9）腺病毒E1B区19KDa与55KDa蛋白编码序列缺失；

（10）腺病毒E1A的启动子为人端粒酶逆转录酶启动子、癌胚抗原启动子、甲胎蛋白启动子、前列腺素特异性抗原的启动子或缺氧诱导因子-1调控的缺氧反应元件启动子；优选为人端粒酶逆转录酶启动子；

（11）腺病毒E1A表达框与外源基因所在表达框的方向相反；

（12）腺病毒E1A表达框与外源基因所在表达框之间包含第二绝缘子序列，所述第二绝缘子序列与第一绝缘子序列相同或者不同；具体地，所述第二绝缘子序列如SEQ ID NO：13所示；

（13）所述腺病毒为C亚属。

5.一种重组腺溶瘤病毒，其中，p53基因和GM-CSF基因能够在同一个表达框内各自独立地表达。

6.一种重组腺溶瘤病毒，其含有权利要求1至4中任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体；具体地，其由权利要求1至4中任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体在HEK293细胞中重组得到。

7.选自如下的重组溶瘤腺病毒：

重组溶瘤腺病毒SG655-GMP1，其于2013年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC-V201336；或

重组溶瘤腺病毒SG655-GMP2，其于2013年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC-V201337。

8.一种分离的核苷酸序列，其为依次连接的如下序列：

穿膜肽编码序列、编码一个或多个甘氨酸的序列、p53基因；

具体地，所述穿膜肽编码序列为11个精氨酸的编码序列；

具体地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

9.权利要求1至4中任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体或者权利要求5至7中任一项所述的重组溶瘤腺病毒在制备治疗和/预防和/或辅助治疗癌症或者抗肿瘤的药物中的用途；具体地，所述癌症或者肿瘤为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌。

10.权利要求1至4中任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体或者权利要求5至7中任一项所述的重组溶瘤腺病毒在制备杀伤肿瘤细胞特别是肿瘤干细胞的药物中的用途；具体地，所述肿瘤细胞为选自下列肿瘤的细胞：

肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌。