[发明专利]一种携带人穿膜肽p53与GM-CSF基因的重组溶瘤腺病毒及其用途

说明书

技术领域

本发明属于基因工程学和肿瘤学，涉及一种含人类穿膜肽p53基因和GM-CSF基因的重组溶瘤腺病毒及其用途。 

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的一大类疾病，随着社会经济的发展，肿瘤的主要危险因素不但未得到有效控制，反而愈演愈烈，是其发病率和死亡率持续上升。目前恶性肿瘤的常规治疗难以收到预期的疗效，特别是化疗药物的治疗指数低，毒副作用大。近几年，包括基因治疗在内的生物治疗成为肿瘤临床中不可或缺的一部分。我国的重组腺病毒p53注射液“Ad-p53”已于2004年上市，成为世界上第一个上市的癌症基因治疗药物（Mol Cancer Ther.2008;7:1598）。 

腺病毒是基因治疗最常用的病毒载体，据据J Gene Med统计，截至2013年6月，全球共有1902项基因治疗进入临床试验，其中使用腺病毒作为载体的数量最多，达453项，占总数的23.2%。溶瘤腺病毒是经改造能对肿瘤基因表型的缺陷产生特异性杀伤作用及能特异性把肿瘤药物靶向到肿瘤部位的条件增殖型病毒（Biochim Biophys Acta.2008;1785(2):217-31），其本身具有裂解杀伤肿瘤细胞的能力（如我国上市药物H101，又称Onyx-015），又可介导外源基因高效表达，因而是肿瘤基因治疗理想的载体。利用溶瘤腺病毒携带肿瘤治疗基因，可使治疗基因随病毒的复制增殖DNA拷贝数显著增加，显著提高外源基因的表达量，通过溶瘤病毒与治疗基因的双重作用，促进肿瘤细胞的死亡；释放后的子代病毒又可以感染周围肿瘤细胞，通过级联放大效应，大量杀伤肿瘤细胞。同时，溶瘤腺病毒在肿瘤病灶的作用亦 能引起免疫反应，达到局部的抗肿瘤效果，和其他肿瘤的治疗手段也无任何交叉耐药的作用（Methods Mol Med.2004；90:71-90）。 

外源基因方面，溶瘤腺病毒可携带的治疗基因包括，抑癌基因、自杀基因、细胞因子、RNA干扰序列等。其中，应用较为成功的包括p53与GM-CSF。p53是一种转录因子，控制着细胞周期的启动，在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。p53的功能包括：阻滞细胞周期；促进细胞调亡；维持基因组稳定；抑制肿瘤血管生成等，同时p53能有效增强免疫反应，是一个良好的肿瘤疫苗。我国首个基因治疗上市药物“今又生”（重组人p53注射液）即采用非增殖型腺病毒携带人p53基因。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF），是由活化的T细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞产生的一种蛋白质因子，能诱导巨噬细胞、树突状细胞（Dendritic Cell,DC）的分化成熟，增强免疫反应。多种溶瘤病毒携带GM-CSF基因的基因-溶瘤病毒治疗系统已经进入临床试验，如单纯性疱疹病毒(T-Vec;Amgen公司)，痘苗病毒（Pexa-Vec；Jennerex公司），腺病毒（KH901；康宏制药股份有限公司），均取得非常不错的临床疗效。 

p53基因和GM-CSF基因各自的治疗作用已在多种类型恶性肿瘤（例如肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌等）中得到证实，可以参见Cold Spring HarbPerspect Biol.2010;2(9):a001222；Nat Rev Cancer.2009;9(10):749-58；Immunotherapy.2013;5(8):817-9；Immunol Rev.2002;188:147-54。 

目前尚需要一种重组溶瘤腺病毒载体和溶瘤腺病毒，其能够同时高效表达人类p53基因和GM-CSF基因，在肿瘤细胞内特异增殖，并有效地杀伤肿瘤细胞。 

发明内容

本发明人结果深入的研究和创造性的劳动，得到了一种重组溶瘤 腺病毒载体和重组溶瘤腺病毒。具体地，该腺病毒E1A由人端粒酶逆转录酶启动子控制；E1B区19KDa与55KDa蛋白编码序列缺失，作为外源基因表达框的插入位点；E1A与外源基因表达框之间插入一段绝缘子序列，避免两个表达框的互相干扰。穿膜肽p53与GM-CSF基因由组成型强启动子（如CMV启动子、CAG启动子）控制，两者通过Furin-2A相连保证翻译后能剪切形成两个独立的蛋白；p53基因前包含一段11R穿膜蛋白序列，以增强病毒对肿瘤细胞的二次感染效率。