[发明专利]一种猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法

权利要求书

1.一种猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法，包括如下步骤：

1）首先设计与合成六个特异性引物：正向内部引物FIP、反向内部引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环形引物LF和反向环形引物和LB，其核苷酸序列分别如SEQ ID No1-SEQ ID No6所示，具体如下：

FIP：5′-CAGGAATACAATATCCGTGTAACCATTTTGGTTAAGTGGGGGGTCTT-3′

BIP：5′-GAGGCCTACGTGGTCTACATTTTTCAAACAACAAAAGAAATCAGCTATG-3′

F3：5′-CACTTCGTAATGGTTTTTATTATTTA-3′

B3：5′-TCCACTATTGATTACTTCCAAC-3′

LF：5′-AACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATC-3′

LB：5′-TTTCCAGCAGTTTGTAGTCTCAGC-3′

2）从培养的细胞中提取病毒DNA模板；

3）目的片段的获得：配制LAMP和PCR反应体系，按照LAMP和PCR反应程序进行扩增反应得到目的片段；

4）定性LAMP检测和定性PCR检测：将上述LAMP和PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出与PCV2相应的约200bp大小的特异片段即为阳性，没有扩增出该特异性片段即为阴性。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法，其特征在于，步骤3）中所述LAMP反应体系为：所述LAMP反应体系为：10×Thermopol Reaction Buffer3.5μL，六个特异性引物（FIP、BIP、F3、B3、LF、LB）各1μL，基因组DNA5μL，去离子水补加至总体积25μL；所述LAMP反应程序为：94℃5min，59℃40min，80℃10min。

3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法，其特征在于，步骤3）中所述PCR反应体系为：10×buffer2.5μM，dNTPs0.75μM，正向外引物F3、反向外引物B3各0.5μM，2.5U DNA聚合酶，模版DNA1μL，去离子水补加至总体积25μL；所述PCR反应程序为：95℃5min，95℃30S，55℃30S，72℃30S，72℃5min，35个循环。

4.权利要求1所述的猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法在制备环介导等温扩增试剂盒中的应用。

5.权利要求1所述的猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法在快速、灵敏和定性检测猪圆环病毒2型中的应用。