[发明专利]一种猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法

说明书

技术领域

本发明属分子生物学领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法。

背景技术

目前，常用于病毒检测的方法有酶联免疫吸附反应（ELISA）、定性PCR技术和实时荧光定量PCR技术。ELISA灵敏度较高，但检测结果可能包括假阳性。定性PCR技术成本低、易于操作，但灵敏度比较低，且由于其扩增产物需通过凝胶电泳分析一次，极易产生污染。实时荧光定量PCR技术虽有高灵敏度、高特异性等特点，但该实验对检测人员要求较高且需要昂贵的Real-time PCR系统设备。环介导等温扩增技术简单、快速、灵敏度高、特性性强、重复性好等特点而被广泛应用。

环介导等温扩增（LAMP）技术针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件(65℃左右)保温约60min，即可完成核酸扩增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带。还可通过设计两条环引物可使反应速度提升1/2-1/3。

环介导等温扩增技术主要有如下几种检测方法：

1）扩增得出的产物经琼脂糖凝胶电泳来检验分析，扩增出的LAMP特征性条带，分析是否含有所需的片段。

2）扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀透过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测。

3）扩增结果可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色。在紫外灯或日光下通过肉限进行判定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR GreenI的橙色不变。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种猪圆环病毒2型环介导等温扩增（LAMP）检测方法，通过Primer Explorer V3设计的三对特异性引物可以对特定片段在等温条件下进行快速、准确的扩增，同时又保证了实验的特异性。

本发明首先通过DNAstar分析，在猪圆环病毒2型基因组内寻找保守序列，在获得的保守区域设计特异性引物，然后通过扩增获得大量的目的片段。对目的片段进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。扩增结果也可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀透过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测。

本发明所述猪圆环病毒2型LAMP检测方法，包括如下步骤：

1）特异性引物的设计和合成

本发明首先设计并合成了六个特异性引物：正向内部引物（FIP）、反向内部引物（BIP）、正向外引物（F3）、反向外引物（B3）、正向环形引物（LF）和反向环形引物（LB），并由上海生物工程有限公司合成。

所述六个特异性引物的序列分别如SEQ ID No1、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5、SEQ ID No6所示，具体如下：

FIP：5′-CAGGAATACAATATCCGTGTAACCATTTTGGTTAAGTGGGGGGTCTT-3′

BIP：5′-GAGGCCTACGTGGTCTACATTTTTCAAACAACAAAAGAAATCAGCTATG-3′

F3：5′-CACTTCGTAATGGTTTTTATTATTTA-3′

B3：5′-TCCACTATTGATTACTTCCAAC-3′

LF：5′-AACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATC-3′

LB：5′-TTTCCAGCAGTTTGTAGTCTCAGC-3′

2）从培养的细胞中提取病毒DNA模板

按照Blood Viral DNA/RNA kit(BIOMIGA Inc,San Diego,CA)的说明书来提取培养的细胞中的病毒DNA或RNA，分别提取猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒1型（PCV1）、猪细小病毒（PPV）、伪狂犬病毒（PRV）的DNA，再提取猪流行性腹泻病毒（PED）、猪传染性胃肠炎（TGE）、猪轮状病毒（RV）、猪蓝耳病毒（PRRS）的RNA，提取的RNA经Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H^-)(Takara Corp.,Japan）逆转录作用分别得到各自病毒的cDNA，将得到的DNA和cDNA保存在-70℃冰箱。

3）目的片段获得