[发明专利]一种基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及分子学和分类学领域，特别涉及一种基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白。 

背景技术

随着生物技术的发展，抗体药作为一种具有特效的新型治疗药物，具有见效快，特异性好，疗效显著，副作用小等众多优点。抗体药的研发和生产势必会成为各大药厂药物研发和生产的重点发展方向。除了用作治疗的抗体，国内外还有很多公司在生产数量极其庞大的科研和诊断检测用抗体，例如美国的Cell Signaling，Millore，Abcam和Santa Cruz等公司。而抗体药和诊断检测及科研用的制备和纯化需要蛋白A作为亲和层析介质。蛋白A是金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)细胞壁的一种组成成分，共有5个结构域，D，E，A，B，C，每个结构域都由三个α-螺旋构成，结构上具有一定的同源性。蛋白A对人类IgG1和IgG2免疫球蛋白，以及小鼠IgG2a和IgG2b免疫球蛋白具有高亲和性，对人类IgM，IgA和IgE，以及小鼠的IgG1和IgG3具有中等程度的亲和性。 

在纯化抗体时，将蛋白A交联固定在惰性层析介质上，利用抗体与蛋白A的结合进行亲和层析，可以获得高纯度的抗体。用于抗体纯化的固定化蛋白A介质是能多次重复使用的。在抗体纯化过程中，有很多污染物会残留在固定化蛋白A介质里，例如脂类，多糖，蛋白质，细菌细胞碎片以及病毒颗粒等。要在抗体洗脱后去除这些污染物，通常要进行就地清洗(Clean In Place，CIP)，以使固定化蛋白A介质获得再生。最常用的就地清洗的试剂是0.1-1M的氢氧化钠(NaOH)溶液。NaOH溶液作为就地清洗试剂具有很多优点，例如除了能够去除常规的蛋白质和核酸残留之外，还能够轻松地杀死细菌，霉 菌等污染微生物，可以将脂类等疏水性的杂质溶解和去除，可以根据不同的污染程度选择不同浓度的NaOH溶液，价格便宜，而且就地清洗完毕以后，只需要用水或者磷酸缓冲液等清洗介质就可以将NaOH轻松去除。但是NaOH具有强碱性，用于就地清洗的NaOH溶液pH会达到13以上，对于天然的蛋白A来说，这种严苛的洗脱条件是不能承受的，会造成蛋白A的变性和破坏，从而丧失对抗体的结合能力。 

鉴于上述问题，亟待有一种可抗高碱性条件的改造蛋白的出现，从而可方便的多次重复被利用于抗体药的纯化，降低抗体药的生产成本的同时提高了抗体药的纯化率和产率。 

发明内容

本发明目的之一在于提供一种基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白。本发明的总体目的是利用基因工程改造技术将原有金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域对应的基因序列发生改变，从而通过后期诱导表达之后获得新的免疫球蛋白-亲和蛋白，产生的新的免疫球蛋白-亲和蛋白能抗高碱性条件，从而可以保证在抗体药物纯化结束后用氢氧化钠清洗的带有免疫球蛋白-亲和蛋白的惰性层析介质过程中免疫球蛋白-亲和蛋白结构域不被破坏，从而提高用于纯化抗体药物的免疫球蛋白-亲和蛋白的利用率。本发明方法对仪器设备要求低，操作简单，很大程度上降低了抗体药物纯化的成本。 

为实现上述目的，一种用于基因工程改造免免疫球蛋白-亲和蛋白的引物组，其特征在于，包括， 

正向引物C-N6T-F，其为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列； 

反向引物C-N6T-R，其为SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列； 

正向引物C-N28T-F，其为SEQ ID No.3所示的多核苷酸序列； 

反向引物C-N28T-R，其为SEQ ID No.4所示的多核苷酸序列。 

优选的是，所述引物组中C-N6T-F和C-N6T-R用于金黄色葡萄球菌的蛋 白A的C结构域中第6个天门冬酰胺突变成苏氨酸的改造，突变位点简写为N6T，所述引物组中C-N28T-F和C-N28T-R用于金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域中第28个天门冬酰胺突变成苏氨酸的改造，突变位点简写为N28T。 

一种基因工程改造的免疫球蛋白-亲和蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白-亲和蛋白为使用权利要求1所述引物组通过基因工程改造方法获得的免疫球蛋白-亲和蛋白，所述改造后的免疫球蛋白-亲和蛋白可用于抗体药物纯化。 

一种基因工程改造免疫球蛋白-亲和蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤： 

1)根据金黄色葡萄球菌的蛋白A的C结构域的基因序列通过全序列基因合成出一段DNA，备用；