[发明专利]一种检测黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法与应用

权利要求书

1.一种检测黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于，以中国地方黄牛基因组DNA序列为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg^＋＋、dNTPs存在的情况下，利用聚合酶链式反应引物P₁和P₂，进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定黄牛单核苷酸多态性。

所述的聚合酶链式反应引物P₁为：

上游引物P₁-F：5’-CCCTTCTTTCCCCAGGTTAGAGAC-3’24nt

下游引物P₁-R：5’-GGGCTCGGGAGCATTTATT-3’         19nt

用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的Pax3基因第-580位的碱基多态性；

所述的聚合酶链式反应引物P₂为：

上游引物P₂-F：5’-GCGAAGAGGAGGAGACCGA-3’     19nt

下游引物P₂-R：5’-AGATTCCGAGGGACTGTGAG-3’     20nt

用限制性内切酶HaeIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的Pax3基因第4617位的碱基多态性。

2.权利要求1所述的黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的条件是：25μL反应体系，包括0.625U Taq DNA聚合酶，2×Buffer12.5μL<内含Mg⁺⁺、dNTPs等>，0.45μL黄牛基因组DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL和灭菌超纯水10.8μL。

所述P₁引物所需PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸35s，30～35个循环；72℃延伸10min。

所述P₂引物所需PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，64.0℃退火30s，72℃延伸40s，30～35个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度都为3.0%。

4.根据权利要求1所述的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，检测到的中国地方黄牛Pax3基因编码区的多态性为：基因组第-580位的T>G突变;基因组第4617位的A>C突变。

5.权利要求1所述的黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性，其特征在于，通过电泳判定黄牛Pax3基因第-580位的碱基多态性为：GG基因型表现为210bp条带；TG基因型表现为210、188和22bp条带；TT基因型表现为188和22bp条带。

6.权利要求1所述的黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性，其特征在于，通过电泳判定黄牛Pax3基因第4617位的碱基多态性为：AA基因型表现为222和127bp条带；AC型表现为222、127、91和36bp条带；CC基因型表现为222、91和36bp条带。