[发明专利]一种检测黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及中国地方黄牛单核苷酸多态性（SNP）分子标记的筛查和检测，特别涉及一种检测黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的方法。 

背景技术

我国肉牛业生产实力与世界畜牧业发达国家相比还存在相当大的差距。培育中国专门化肉牛品种，建立现代中国肉牛种牛业，是发展我国肉牛业的战略任务。这就需要通过分子育种技术提高肉牛的培育速度和肉牛品质，并通过现代生物技术加快扩繁，从而快速、高效的选育我国特有的优质牛品种。 

分子标记是遗传标记的重要组成部分，现已成为家畜分子育种的核心技术。遗传标记大致可分为两类：Ⅰ类是间接反映DNA水平遗传变异的遗传标记，如形态标记、细胞标记和生化标记；Ⅱ类是直接反映DNA水平遗传变异的分子标记。分子标记之所以能反映DNA水平的遗传变异情况主要是基于被研究的DNA分子由于点突变、缺失、插入、易位、倒位、重排或存在长短与重排不一的重复机制而产生多态性。如今分子标记在生命科学研究领域中已经被广泛应用，在遗传标记中占主导地位。 

应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而提高肉牛的生长速度和改善肉品质的先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的遗传标记，其次是建立其基因多态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。 

PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后，分析突变序列引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。 

Pax3基因属于Pax基因家族的成员，该基因定位于人染色体2号染色体（2q36.1），鼠1号染色体，全长99110bp，含有8个外显子，mRNA全长3112bp，CDS在mRNA的382bp-1593bp区域。Pax3属于Pax基因家族的第一类，分布于细胞核，是一类重要的转录调控因子，在胚胎发育过程中对组织和器官的分化起着重要的调控作用，是强有力的生肌性诱导物，能使多能干细胞转变为生肌性细胞，在骨骼的发育和再生过程中起着至关重要的作用。尤其对脊椎动物四肢的形成起重要作用。除此之外，Pax3基因突变也与某些疾病有关，Pax3基因表达发生在神经管细胞开始分化之前，在整个神经管轴的侧翼板、神经嵴细胞及顶板均有表达，Pax3突变或表达失调会引起某些神经系统相关的出生缺陷和遗传综合征。例如人的神经管畸形（NTDs）（Lu W,Zhu H,Wen S,et al.Screening for novel Pax3polymorphisms and risks of spina bifida[J].Birth Defects Research Part A:Clinicaland Molecular Teratology,2007,79(1):45-49）、Waardenburg综合症1型、2型和3型(Tassabehji M,Read A P,Newton V E,et al.Mutations in the Pax3gene causing Waardenburg syndrome type1and type2[J].NatGenet,1993,3(1):26-30；Hoth C F,Milunsky A,Lipsky N,et al.Mutations in the paired domainof the human Pax3gene cause Klein-Waardenburg syndrome(WS-III)as well as Waardenburg syndrome type I(WS-I)[J].Am J HumGenet,1993,52(3):455-462)。 

目前，国内外对黄牛的Pax3基因研究甚少，主要集中在人和小鼠等方面，而且大都集中于基因功能方面，关于家畜Pax3基因遗传变异或者SNP 研究的研究国内外尚未见报道。因此，对中国地方黄牛Pax3基因遗传变异领域的研究至关重要，并且将该基因位点的遗传变异与黄牛生长性状（如：体重、体高、体长、日增重等性状）关联分析，可以为我国黄牛分子育种提供理论依据。 

发明内容