[发明专利]来源于大豆的根特异性启动子GmPRP2p-369及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于大豆的根特异性启动子GmPRP2p-369及其应用。

背景技术

启动子是基因的组成部分，控制基因表达的起始和表达程度。在转基因育种中，外源基因在植物体中的精确调控主要是通过合适的启动子实现的。目前，在基因工程中广泛使用的是组成型启动子，但是由于组成型启动子驱使目的基因在植物组织中的表达是恒定和持续的，不受时空和外界因素的限制，会过度消耗细胞内的物质和能量，产生大量异源蛋白质或代谢产物，破坏了植物原有的生理代谢平衡，导致植物生长异常甚至死亡。与组成型启动子相比，根特异性启动子它所驱动的外源基因在受体植物根中表达，克服了组成型启动子由于持续、高效的启动外源基因非特异性表达而造成的细胞物质的过度消耗。随着转基因植物安全标准的提高，包括所有商业化转基因农作物在内，要求必须对所用启动子的表达活性、潜在重组能力、对周边环境以及安全性影响进行详细的研究。

大豆是一种重要的粮油饲兼用作物，在我国大豆产区大多处于干旱、盐碱及高寒等区域，应用的大豆品种耐逆性不强，严重的旱涝病虫害等非生物和生物逆境胁迫显著影响大豆产量。目前在转基因大豆中使用的都是CaMV35S启动子，根特异启动子应用到大豆转基因中，为大豆转基因研究提供更加丰富的启动子元件，同时也为培育耐旱、耐盐、耐冷等转基因大豆新品种提供一种手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有启动子功能的DNA分子。

本发明所提供的具有启动子功能的DNA分子，来源于豆科大豆属栽培大豆（Glycine max（L.）Merr.）Williams82，是下述a）-c）中任一DNA片段：

a）至少含有序列表中序列2的第694-1062位核苷酸序列，并且从序列2的第694位开始按照序列2的核苷酸序列向序列2的5′端延长，得到长度为369至852bp的任意一个DNA片段；

b）与a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；

c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

在本发明中，所述具有启动子功能的DNA分子为序列表中序列2的第694-1062位核苷酸所示的DNA分子，命名为GmPRP2p-369。

其中，序列表中序列2由1062个核苷酸组成，为序列1的第1-1062位。

含有所述DNA分子（启动子）的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述重组载体为在pC13P1载体的多克隆位点（如SacⅠ和XbaⅠ）插入含有所述DNA分子的DNA片段后得到的重组质粒。

进一步，所述重组载体按照如下方法获得：将所述DNA分子与pEASY-T1载体相连，得到中间载体；用限制性内切酶SacⅠ和XbaⅠ双酶切所述中间载体，将还有所述DNA分子的酶切片段与同样经过限制性内切酶SacⅠ和XbaⅠ双酶切的所述pC13P1载体的骨架片段相连，得到所述重组载体。

所述pC13P1载体是以pCAMBIA1301载体为基础改造得到的环形载体，所述pC13P1载体上不含有任何启动子的序列，用来满足研究启动子功能的需要。

具体而言，所述pC13P1载体的序列如序列表中序列3所示。

所述表达盒可以由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因（来源于所述pC13P1载体）；所述转录终止序列具体为NOS转录终止子（来源于所述pC13P1载体）。

所述DNA分子在植物中启动目的基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。

在所述应用中，所述表达为根特异性表达。

进一步，所述根特异性表达可为根中高表达，具体为根中的表达量显著高于其他组织（如叶柄、叶片主脉、花、果荚外壳）。在其他组织中只存在微量的表达。

在所述应用中，所述目的基因可为GUS基因。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥或大豆。