[发明专利]基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法

权利要求书

1.一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，其特征在于：本方法包括以下步骤：

步骤一、培养基的制备：所述培养基的制备包括斜面培养基的制备及固态培养基的制备，其中：所述斜面培养基的制备，按以下质量体积浓度的组分制备：MgSO₄·7H₂O 1.0 g/L，KH₂PO₄ 1.0 g/L，(NH4)₂SO₄ 1.5 g/L，KCl 0.5 g/L，KNO₃ 1.5 g/L，无水 CaCl₂ 0.1 g/L，酵母提取物 2.0 g/L，柚皮苷 2.5 g/L，琼脂 20 g/L，初始 pH 6.0，1×105 Pa 灭菌20 min；所述固态培养基的制备，按以下重量的组分制备：柚皮粉160g，豆饼粉24g，麸皮1%，KNO₃ 1%，固水比为1:1.5，1×10⁵ Pa灭菌20 min；

步骤二、固态发酵：将棘孢曲霉菌种接种于所述斜面培养基上，28°C培养3-4d，使所述斜面培养基上长满孢子，用无菌生理盐水洗下孢子，并用无菌生理盐水调整菌悬液OD值至0.2，将1 mL单孢子菌悬液接入装有所述固态培养基的250 mL的三角瓶中，每瓶装样量为5 g，于28°C下培养7-8 d；

步骤三、粗酶液的制备：以1:20的固液比，用磷酸盐缓冲液对固态发酵物进行浸泡1 h，搅匀后抽滤并收集滤液，将所述滤液于4°C以12000×g离心10 min，收集上清液即得粗酶液，于0-4°C下保藏备用；

步骤四、酶催化反应：所述酶催化反应为游离柚皮苷的酶催化反应和/或固定化柚皮苷的酶催化反应，其中，所述游离柚皮苷的酶催化反应为：在50 mL的反应体系中，柚皮苷浓度为0.04-0.24g/100 mL，酶用量为4-12 U/mL，以浓度为 0.02 mol/L醋酸-醋酸钠溶液为缓冲液，反应pH 值为3.0-7.0，置于恒温振荡水槽中，反应温度为30-70oC，振荡反应4 h，振速为0-160次/min，从加入酶液开始计时，每30 min取反应液一次，沸水灭活后，冷却至室温；所述固定化柚皮苷的酶催化反应为：在50 mL的反应体系中，加入1 g湿重的树脂，柚皮苷浓度为0.08-0.24g/100 mL，酶用量为4-12 U/mL，以浓度为 0.02 mol/L醋酸-醋酸钠溶液为缓冲液，反应pH 值为3.0-7.0，置于恒温振荡水槽中，反应温度为30-70oC，振荡反应4 h，振速为0-160次/min，期间从加入酶液开始计时，每隔一段时间取反应液一次，并立即用沸水浴灭活20 min，冷却至室温；在其他条件不变的情况下，分别对所述的柚皮苷浓度、酶用量、反应pH值、反应温度及振速进行单因素试验，以确定最佳反应条件；

步骤五、DNS法分析还原糖生成量：采用2, 4-二硝基水杨酸即DNS分析所述酶催化反应的还原糖生成量：取0.2 mL所述反应液与0.6 mL DNS溶液混合，摇匀，100°C水浴15 min，随即取出用自来水冷却，再用蒸馏水定容至5 mL，于520 nm波长下测定吸光值，依据标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量，其中，绘制标准曲线时，以等摩尔比的鼠李糖和葡萄糖组成的混合溶液为标准溶液，其浓度为0-2 mg/mL。

2.如权利要求1所述的一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，其特征在于：所述步骤四中，所述游离柚皮苷的酶催化反应中，柚皮苷浓度为0.2 g/100 mL，酶用量为8 U/mL， pH值为5.0，反应温度为50oC，酶解反应120 min。

3.如权利要求1所述的一种基于DNS分析实现柚苷酶酶解的快速优化方法，其特征在于：

所述步骤四中，所述固定化柚皮苷的酶催化反应中，柚皮苷浓度为0.2 g/100 mL，酶用量为8 U/mL， pH值为5.0，反应温度为50oC，振速为80次/min，酶解反应6 h。