[发明专利]基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物催化的技术领域，尤其涉及一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法。

背景技术

柚皮苷(4,5,7-trihydroxy flavanone-7-β-L-rhamnoglucoside-(1,2)-α-D-glucopyranoside)是一种二氢黄酮糖苷类化合物，它是芸香科植物，如葡萄柚、蜜柚、酸橙等的主要苦味物质，具有抗溃疡、消炎、抗氧化及抑菌等一系列的生物活性，在食品、药品及化妆品等领域具有很好的应用前景。然而，柚皮苷在常温下的溶解性较差，以致其在工业上的应用受到了较大程度的限制，为改善其水溶性或脂溶性，或提高其生理活性、增加新的功能等，进而提高其生物利用度，目前国内外主要采用化学法和酶法对柚皮苷进行改性研究，相比于化学改性法，酶法改性柚皮苷具有选择性强，反应条件温和，产物易分离及对环境危害小等优点，因而具有更好的研究意义和价值。

柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成的复合酶，它催化柚皮苷的水解反应主要有两个过程：首先，柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的作用下分解成鼠李糖和普鲁宁，其次，普鲁宁又在β-D-葡萄糖苷酶的作用下分解成葡萄糖和柚皮素。

在现有技术中，通常采用高效液相色谱法检测柚皮苷的减少量或柚皮素的生成量，来分析柚皮苷的水解过程。在中国专利号为200510014880.9，名称为《一种胃肠安丸中柚皮苷含量的测定方法》及中国专利号为200910073856.0，名称为《接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法》两篇专利文献中，均是通过高效液相色谱法的方法来测定柚皮苷的含量，虽然，此方法准确度高，但是这种方法较为繁琐耗时，对于柚皮苷的大规模测定，例如，在发酵条件优化时，需要消耗大量的人力物力。

鉴于柚苷酶催化柚皮苷生成柚皮素的过程同时也是还原糖生成的过程，且在此过程中还原糖的生成应与柚皮苷的水解和柚皮素的生成具有相关性。因此，本发明人研究和设计了一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，本案由此产生。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，通过DNS分析柚苷酶催化柚皮苷反应过程中产生的鼠李糖还原糖及葡萄糖还原糖的含量，达到快速优化柚苷酶催化柚皮苷的目的，并进一步分析了不同工艺参数对柚皮苷转化过程的影响，进而为利用柚苷酶改性柚皮苷获得特定生物活性的改性产物提供了研究基础。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法，本方法包括以下步骤：

步骤一、培养基的制备：所述培养基的制备包括斜面培养基的制备及固态培养基的制备，其中：所述斜面培养基的制备，按以下质量体积浓度的组分制备：MgSO₄·7H₂O 1.0 g/L，KH₂PO₄ 1.0 g/L，(NH4)₂SO₄ 1.5 g/L，KCl 0.5 g/L，KNO₃ 1.5 g/L，无水 CaCl₂ 0.1 g/L，酵母提取物 2.0 g/L，柚皮苷 2.5 g/L，琼脂 20 g/L，初始 pH 6.0，1×105 Pa 灭菌20 min；所述固态培养基的制备，按以下重量的组分制备：柚皮粉160g，豆饼粉24g，麸皮1%，KNO₃ 1%，固水比为1:1.5，1×10⁵ Pa灭菌20 min；

步骤二、固态发酵：将棘孢曲霉菌种接种于所述斜面培养基上，28°C培养3-4d，使所述斜面培养基上长满孢子，用无菌生理盐水洗下孢子，并用无菌生理盐水调整菌悬液OD值至0.2，将1 mL单孢子菌悬液接入装有所述固态培养基的250 mL的三角瓶中，每瓶装样量为5 g，于28°C下培养7-8 d；

步骤三、粗酶液的制备：以1:20的固液比，用磷酸盐缓冲液对固态发酵物进行浸泡1 h，搅匀后抽滤并收集滤液，将所述滤液于4°C以12000×g离心10 min，收集上清液即得粗酶液，于0-4°C下保藏备用；