[发明专利]一种高效利用脂肪酸生产甲羟戊酸的方法及构建得到的基因工程菌

说明书

技术领域

本发明涉一种高效利用脂肪酸生产甲羟戊酸的方法及构建得到的基因工程菌。

背景技术

甲羟戊酸是甲羟戊酸途径生成异物烯焦磷酸（IPP）的中间代谢产物，是合成甾醇、萜类、类异戊二烯的重要中间体，同时，在化工行业也有重要的用途。目前，甲羟戊酸合成主要有酶法合成、生物催化和化学催化相结合合成、化学合成等方法，但都存在着原料难得，步骤复杂，污染环境，成本较高等问题，而生物法合成甲羟戊酸能够很好的解决以上问题。在生物细胞中甲羟戊酸是由乙酰辅酶A经达三步催化反应得到，合成产物中只有一种具有旋光性的甲羟戊酸，具有较高的经济价值。因此生物法合成甲羟戊酸具有广阔的前景。

生物法合成甲羟戊酸，主要以葡萄糖为碳源，经过糖酵解，产生丙酮酸；丙酮酸在丙酮酸脱氢酶系的作用下生成乙酰辅酶A；乙酰辅酶A进入甲羟戊酸代谢途径，在乙酰乙酰-辅酶A硫解酶，HMG-CoA合酶及HMG-CoA还原酶的催化剂下生成甲羟戊酸。研究者已经在大肠杆菌内过表达乙酰乙酰-辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因(mvaE)以及HMG-CoA合酶基因(mvaS)，以葡萄糖为碳源进行发酵，最终甲羟戊酸产量能够达到47g·L^-1(Tabata et al.,Biotechnology Letters26,1487-1491,2004)。然而以葡萄糖作为起始底物，一分子葡萄糖丢掉两个碳原子生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶进入甲羟戊酸途径生成甲羟戊酸，其理论产率仅为54.8%。如何提高甲羟戊酸合成途径中底物的利用效率，是现有技术需要解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种产甲羟戊酸重组大肠肝菌，是在大肠杆菌中过表达脂肪酸转运蛋白基因(fadL)和脂酰辅酶A合成酶基因(fadD)，得到的重组大肠肝菌。

所述脂肪酸转运蛋白基因(fadL)是指编码外膜蛋白FadL，作为长链脂肪酸的受体，是调控长链脂肪酸跨外膜向内膜转运的重要蛋白，优选Genbank登录号：AAC75404.2。

所述脂酰辅酶A合成酶是将脂肪酸转化为脂酰辅酶A，优选Genbank登录号：AAC74875.1。

本发明还提供一种利用脂肪酸生产甲羟戊酸的方法，是在大肠杆菌中导入脂肪酸转运蛋白基因(fadL)和脂酰辅酶A合成酶基因(fadD)，利用重组大肠杆菌发酵生产甲羟戊酸。

所述利用脂肪酸生产甲羟戊酸的方法，具体步骤如下：

1）获得长链脂肪酸转运蛋白基因(fadL)和脂酰辅酶A合成酶基因(fadD)；

2）构建含有长链脂肪酸转运蛋白基因(fadL)和脂酰辅酶A合成酶基因(fadD)的重组质粒；

3）将步骤2）构建的质粒与质粒pYJM11导入大肠杆菌；

4）利用步骤3）得到的重组大肠肝菌利用脂肪酸发酵生产甲羟戊酸。

所述步骤2）采用pET-30a载体。

所述质粒pYJM11(pACY-mvaE-mvaS)为本课题组前期构建，已发表在：Jianming Yang et al.,Bioresource Technology104,642-647,2012。

所述利用脂肪酸生产甲羟戊酸的方法，优选步骤如下：

1）分别克隆Genbank登录号：AAC75404.2的长链脂肪酸转运蛋白基因(fadL)和Genbank登录号：AAC74875.1的脂酰辅酶A合成酶基因(fadD)；

2）在步骤1）所述基因5’端和3’端分别引入酶切位点，将所述基因克隆到pET-30a载体上，构建重组载体pET-fadL-fadD；

3）将步骤2）得到的重组载体pET-fadL-fadD与pYJM11(pACY-mvaE-mvaS)导入大肠杆菌BL21(DE3)得到重组大肠肝菌；

4）利用步骤3）得到的大肠杆菌利用脂肪酸发酵生产甲羟戊酸。

上述基因来源为化学合成、扩增自微生物或扩增自重组质粒。

上述基因可不做具体限定，只要任何基因合成的蛋白质具有所述功能即可称为脂肪酸转运蛋白基因或脂酰辅酶A合成酶基因。