[发明专利]一种人γδT细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法

权利要求书

1.一种人γδT细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法，其特征在于：

首先制备一种人γδT细胞，包括：（1）用培养的结核杆菌制备结核杆菌耐热性抗原，其具体步骤为：

步骤1：将结核杆菌菌体种子湿重50～100克接种于200ml的苏通式液体培养基内，于37℃培养箱内静止培养2周，然后将其分装到含有10%～30%新生牛血清的250ml的苏通式液体培养基内，每瓶50ml，分装成4瓶，再继续于37℃培养箱内静止培养4周，收集培养的细菌悬液，经4000转/分，离心30分钟以收获结核杆菌菌体；

步骤2：将收集的菌体经生理盐水洗涤2次，再用2倍体积的蒸馏水重悬浮菌体，115℃高压蒸汽处理20分钟，4000转/分，离心30分钟收集上清液，即为Mtb-Hag；

（2）用制备的Mtb-HAg刺激PBMCs，同时加入细胞因子rhIL-2和rhIL-21，其具体步骤为：

无菌条件下用血细胞分离机或50ml注射器采集患者外周静脉血，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞，具体步骤为：1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56℃灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1:2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为1600转/分，1300转/分，均离心7分钟，即得到外周血单个核细胞；将上述分离的PBMCs置于含有刺激剂和细胞因子为1～10μg/ml的Mtb-HAg、50～500IU/ml rhIL-2、5～20ng/ml rhIL-21和1%～10%自体血浆的RPMI1640、AIM-V或GT-T551培养基内，调细胞密度为（1～2）×10⁶/ml，转入细胞培养板、培养瓶或培养袋内，于37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱内培养；

（3）细胞培养72小时后进行半量更换培养液并补加等量的rhIL-2，以后根据细胞生长状态每2～3天进行补加含有等量rhIL-2的培养液，以维持细胞密度为（0.5～2.0）×10⁶/ml；

（4）根据细胞生长状态，第10～15天收获细胞；

将细胞培养24小时即可见γδT细胞沉于培养器皿的底部，并趋于集落化，48小时集落开始变大，培养6～10天即可以看到大的集落和不规则的单个核细胞，对培养10天的细胞进行瑞姬氏染色，发现大多数细胞体积增大，呈椭圆形或不规则形，细胞核大多为椭圆形或圆形，核染色疏松，核膜不规则，有突起，每个细胞可见1个小核仁，呈深蓝色；胞质丰富，染成灰蓝色，形态不规则，有伪足，近核处有淡染现象，也有呈不规则形；取培养10天的细胞100μl，加入100μl0.4%台盼蓝染色液，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，显微镜下计数；

分别取第0、7、14、21和28天的细胞，用含5%新生牛血清和0.1%叠氮纳的PBS洗涤2次，调整细胞密度为1×106/ml，每个检测管内加入50μl细胞悬液，加入荧光标记抗体（抗CD3-FITC、抗TCRγδ-PE）染色，4℃避光孵育30分钟，用上述PBS洗涤2次，加入含有1%多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式细胞仪进行检测，数据文件采用WinMDI软件分析。