[发明专利]一种制备重组肠道病毒EV71型病毒样颗粒的方法

权利要求书

1.一种表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体，含有分别受MOX启动子调控的P1蛋白表达序列和受DAS启动子调控的蛋白酶表达序列。

2.如权利要求1所述的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述蛋白酶表达序列为3C蛋白表达序列；或者，所述蛋白酶表达序列为3CD蛋白表达序列。

3.如权利要求2所述的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述P1蛋白表达序列如SEQID NO：4所示；所述3C蛋白表达序列如SEQ ID NO：5所示；所述3CD蛋白表达序列如SEQ ID NO：6所示。

4.如权利要求1所述的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述多顺反子真核表达载体有5’至3’方向排列的DAS启动子，蛋白酶表达序列，AOX1（TT）转录终止序列，MOX启动子，P1蛋白表达序列，以及AOX1（TT）转录终止序列。

5.如权利要求4所述的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述DAS启动子为汉逊酵母二羟基丙酮合成酶基因启动子，该启动子的序列如SEQ ID NO：7所示；所述MOX启动子为汉逊酵母甲醇氧化酶基因启动子，该启动子的序列如SEQ ID NO：8所示；所述AOX1（TT）转录终止序列如SEQ ID NO：9所示。

6.如权利要求1所述的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体是由pPICZB质粒改造获得。

7.权利要求1-6任一权利要求所述表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体的制备方法，步骤如下：

1）采用DAS启动子替换pPICZB质粒中的AOX1启动子，构建获得pDASZ质粒；

2）采用MOX启动子替换pPICZB质粒中的AOX1启动子，构建获得pMOXZ质粒；

3）将pDASZ质粒通过BglII与BamHI酶切后连接的方式插入BglII酶处理后的pMOXZ质粒，得到带有不同启动子的表达载体pMDZ；

4）将蛋白酶表达序列以及P1蛋白表达序列通过酶切连接的方式插入真核表达质粒pMDZ，获得P1蛋白的表达受MOX启动子调控，且蛋白酶的表达受DAS启动子调控的表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核质粒。

8.一种肠道病毒EV71型病毒样颗粒的表达系统，包括酵母细胞以及位于酵母细胞内的权利要求1-6任一权利要求所述表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体。

9.如权利要求8所述的肠道病毒EV71型病毒样颗粒的表达系统，其特征在于，所述酵母选自酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、脆壁克鲁维氏酵母、乳酸克鲁维氏酵母，以及栗酒裂殖酵母中的任一种。

10.权利要求1-6任一权利要求所述表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体、权利要求8-9任一权利要求所述表达系统，以及权利要求7所述制备方法在制备手足口病疫苗中的应用。