[发明专利]一种制备重组肠道病毒EV71型病毒样颗粒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，具体涉及一种制备重组肠道病毒EV71型病毒样颗粒的方法、多顺反子表达载体和表达系统。

背景技术

手足口病是一种主要由肠道病毒引起的威胁5岁以下低龄儿童健康的病毒性传染病，主要感染途径为粪-口传播。症状包括发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，少数患儿可出现心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎、急性迟缓性麻痹、神经源性肺水肿等并发症，个别病情进展较快的重症患儿会导致死亡。手足口病已在世界多个国家引起爆发性流行，尤其近几年的大规模爆发流行及死亡率明显升高。中国最早的手足口病报道于上世纪80年代初，而爆发性流行始于2007年。自2008年5月起，中国将其规定为法定报告管理的丙类传染病。根据卫生部（http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/wsb/）统计，2008-2011年中国手足口病发病及死亡人数急速增长，自2008年开始，中国的手足口病疫情呈现了不可控的爆发性流行，发病人数及死亡人数明显上升，2010年的发病人数近180万，而2007年的时候仅8万多，仅仅3年手足口病的发病人数就增长了20倍，如此可怕的增长趋势不得不引起卫生部门的极大重视，如何预防和治疗手足口病是中国政府必须在短期内克服的一大公共卫生难题。

手足口病可由20多种肠道病毒感染引起，其中以肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）和柯萨奇病毒（Coxsackievirus，CV）A组16型的感染率和发病率最高。

肠道病毒71型根据基因序列同源性差异，可分为A、B、C三种基因型，其中B型与C型又可进一步细分为B1～B5、C1～C4亚型。不同基因型的流行趋势呈现一定的地域差异，而同一地区不同时间流行的EV71基因型又有所不同。但是从1997年开始，EV71在中国的流行趋势较稳定，主要以C4型为主。

肠道病毒71型属于小RNA病毒科肠道病毒属。EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径约为24-30nm。病毒衣壳蛋白内部包裹着一条单股正链RNA，全长约7408核苷酸，由一个开放阅读框（open reading frame，ORF）和两端的5’，3’非编码区（untranslated region，UTR）组成。ORF编码一个较大的多聚前体蛋白，由P1、P2、P3三个前体蛋白组成，P1编码病毒的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP1包含主要的中和抗原表位所在的区域，VP1常作为EV71的基因型鉴别依据。VP1、VP2、VP3、VP4蛋白先形成亚基，再由亚基组成病毒颗粒，其中VP4包埋在病毒颗粒的内侧，其他三种衣壳蛋白均暴露在病毒颗粒的表面。P2、P3编码非结构蛋白，包括2A、2B、2C、3A、VPg（3B）、3C和3D。2A、3C是特异性蛋白水解酶，主要负责自裂解P1、P2、P3前体蛋白，VPg是病毒基因组RNA的5’末端结合蛋白，3D是RNA聚合酶。

肠道病毒家族的前体蛋白的剪切过程比较复杂，不过大多都大同小异，以脊髓灰质炎与EV71为例，ORF表达的多聚前体蛋白首先裂解为P1、P2、P3，继而再进一步经2A、3C和病毒RNA等的作用裂解为各种衣壳蛋白亚基和非结构功能蛋白。其中VP0（VP2+VP4）的裂解位点可能主要与病毒成熟和RNA包裹有关，VP1与2A之间（P1与P2之间）的位点由2A蛋白酶识别，其他单体蛋白之间的裂解都与3C/3CD有关。

EV71呈全球分布，无明显的地域性，流行季节为夏秋季，但全年均可发生感染。人是EV71的唯一自然宿主，感染者为唯一传染源。

EV71的衣壳蛋白VP1具有最多的型特异性中和位点，因此VP1蛋白编码基因序列与病毒血清型具有较高的相关性，被用于病毒的型别鉴定和基因进化分析，除了VP1蛋白编码基因外，也有利用VP2、VP4蛋白的编码序列进行分析，但VP1全基因序列为公认的进行基因特征和进化分析的标准区域，用于EV分子流行病学研究。B亚型主要流行于20世纪70年代的美国和澳大利亚，A、B1、B2型毒株自1987年以来未见报道，其流行似乎已经终止。中国大陆地区，自1998年以来只有C4亚型EV71流行的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定、高效表达肠道病毒EV71型病毒样颗粒的表达质粒、表达系统以及表达EV71病毒样颗粒的方法。