[发明专利]传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，具体涉及传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术：

传染性皮下及造血组织坏死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV）是世界各地养殖和野生对虾的重要病毒性病原之一。该病毒的感染宿主范围广、危害非常严重；对细角滨对虾（Litopenaeus stylirostris）有很高致病性，能造成其幼体和仔虾高达90%的死亡率；也会导致凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）慢性矮小残缺综合症（Runt-deformity syndrome,RDS），使养殖凡纳滨对虾规格参差不齐，产量下降，造成高达50%的经济损失。因此，国际兽疫局（OIE）将IHHNV引起的疾病列为必须报告的重要的水生动物病毒性疫病之一。通过原位杂交方法显示IHHNV普遍存在于我国的很多养殖对虾中。但是目前对IHHNV引起的对虾病害尚无有效的治疗方法,只能预防,避免与病毒病原体的接触是最有效的预防措施,而这又主要依赖于早期的快速诊断。因此,建立IHHNV快速、有效、准确的检测和诊断技术是预防此类疫病的重要技术手段之一。

近年来基于临床组织病理学、免疫学以及PCR技术等的各种诊断方法已被用于IHHNV的检测。但是现有的这些方法都存在一定的不足，例如：基于组织病理学的方法不仅操作繁琐、费时，而且灵敏度较低；基于免疫学的方法虽然具有敏感性高、检测快速等特点，可用于大批标本的检测，但对新鲜样品进行检测时出现的假阳性问题在一定程度上还限制着该方法的广泛应用；而PCR方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。

LAMP是由日本学者Notomi发明的一种新型核酸扩增技术，该技术针对靶基因的6或8个区域设计4或6条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温条件下即可完成核酸扩增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带。LAMP技术在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应的特异性和缩短了检测时间；特别是它不需使用昂贵的热循环仪，凝胶电泳和紫外检测等设备，降低了成本，已广泛应用于病原微生物的检测。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP检测引物组。

所述的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物：

所述的一对外引物，其核苷酸序列为：

IHHNV-F3：GAGACAACCGACGACATC（SEQ ID NO.1）；

IHHNV-B3：TCTCTGATGACGAAGGTGT（SEQ ID NO.2）；

所述的一对内引物，其核苷酸序列为：

IHHNV-FIP：TTGTGTTCCGCTACTACAGCTCGATCATGGAAGCAATGGA（SEQ ID NO.3）；

IHHNV-BIP：TGAAGGGACTCCCAACGGATCTCACTCTCTTCCAGTCG（SEQ ID NO.4）；

所述的一对环引物，其核苷酸序列为：

IHHNV-LF：CATCGGTAGGTTCCAGTCG（SEQ ID NO:5）；

IHHNV-LB：CGGACGAAATGGACGGAA（SEQ ID NO:6）。

本发明的第二个目的是提供一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照质控品、阴性对照质控品和LAMP检测引物组，其特征在于，所述的LAMP检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物：

所述的一对外引物，其核苷酸序列为：

IHHNV-F3：GAGACAACCGACGACATC（SEQ ID NO.1）；

IHHNV-B3：TCTCTGATGACGAAGGTGT（SEQ ID NO.2）；

所述的一对内引物，其核苷酸序列为：

IHHNV-FIP：TTGTGTTCCGCTACTACAGCTCGATCATGGAAGCAATGGA（SEQ ID NO.3）；