[发明专利]一种猪圆环病毒2型高敏感细胞系的制备方法

权利要求书

1. 一种对猪圆环病毒2型高敏感的细胞系，其特征在于：

用RNA干扰技术沉默PK-15细胞中与PCV2感染密切相关的HMGCR基因，并获得稳定细胞系，利用此细胞系培养PCV2病毒，可使病毒TCID50达到10^8-9/mL。

2. 权利要求1所述的对猪圆环病毒2型高敏感的基因沉默细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1）HMGCR基因沉默载体的制备

1.1）用于HMGCR基因沉默的shRNA序列：

根据猪PK-15细胞的HMGCR基因序列特点，设计用于HMGCR基因沉默的shRNA，其序列为

5'-caccgcagaaactgacacctcaag cttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3'；

同时设有阴性对照shRNA，其序列为：

5'-caccgttc tccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3'；

1.2）HMGCR基因沉默载体：

将设计的shRNA序列合成并连接到pGPH1/GFP/Neo siRNA (GenePharma, China)表达载体上；

2）HMGCR基因沉默细胞的制备

2.1）载体线性化：提取HMGCR基因沉默质粒，用限制性内切酶BamHI酶切，然后乙醇沉淀回收线性DNA片段，用无菌ddH2O溶解；

2.2）脂质体转染：将线性化的载体按照脂质体Fugene HD说明书的方法转染PK-15细胞，DMEM培养液，5 % CO2，37 ℃培养；

2.3）HMGCR基因沉默细胞的获得及鉴定：上述经脂质体转染后的细胞用G418筛选8-10天后，获得抗性细胞；采用Western blotting方法和Relative quantitative real-time PCR对所获得的细胞进行鉴定，得到HMGCR基因沉默的细胞； 

3）HMGCR基因沉默细胞活力的测定

按照CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)的方法测定上述HMGCR基因沉默细胞的活力；

4）对猪圆环病毒2型（PCV2）高敏感的基因沉默细胞的筛选

选取上述HMGCR基因沉默且活力较强的细胞，接种PCV2病毒，用IFA法测定病毒滴度、用Relative quantitative real-time PCR测定病毒基因组拷贝数。

3.一种真核表达载体pGPH1/GFP/Neo siRNA-HMGCR，其特征在于：是在pGPH1/GFP/Neo siRNA表达载体的基础上，插入人工合成的shRNA片段而成。

4. 用于沉默PK-15细胞的HMGCR基因的shRNA，其特征在于其序列为：

Sense：

5'-caccgcagaaactgacacctcaagcttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3'；

Antisense：

5'-gatccaaaaaagcagaaactgacacctcaagctctcttgaagcttgaggtgtcagtttctgc-3'；

阴性对照shRNA，其序列为：

Control Sense：

5'-caccgttctccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3'；

Control Antisense：

5'-gatccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgacgtgacacgttcggagaac-3'。

5.HMGCR基因沉默细胞的Relative quantitative real-time PCR鉴定方法，用于HMGCR基因沉默细胞的鉴定，其特征在于引物序列如下：

HMG3：5'-tatccgtttccagtccaggt-3'；

HMG4：5'-ttacagcagcaggtttcttg-3'。