[发明专利]一种猪圆环病毒2型高敏感细胞系的制备方法

说明书

技术领域：

本发明提供了一种对猪圆环病毒2型（PCV2）高敏感的细胞系，同时还公开了该细胞系的制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

猪圆环病毒2型引起的断奶仔猪多系统衰竭综合症给养猪业造成了巨大的经济损失。目前，本病无有效的治疗方法。另外，虽然利用常规PK-15细胞可以培养PCV2，但PCV2难培养、生长慢，全病毒培养物在灭活前的病毒含量也只能达到10^5.5-6.0 TCID50/mL，严重制约了PCV2全病毒灭活疫苗的生产，因此，研究获取足量PCV2的有效方法十分必要。目前，提高PCV2滴度的方法主要有：

（1）在细胞培养液中填加免疫激活剂、氨基葡聚糖等化学物质。但这些方法操作复杂、花费较高，不利于在工业化生产PCV2全病毒灭活疫苗中使用。

（2）筛选对PCV2高度易感且稳定的细胞系。

但国内外相关研究均是用常规PK-15细胞经过有限稀释后获得对PCV2敏感的细胞系，尚未见用转基因或基因沉默的方法制备PCV2高易感细胞系的报道。

发明内容：

本发明公开了一种对猪圆环病毒2型高敏感的细胞系，利用此细胞系培养PCV2病毒，可使病毒TCID50达到10^8-9/mL。

本发明还提供了猪圆环病毒2型高敏感的基因沉默细胞系的制备方法，适用于人工制备猪圆环病毒2型高敏感的细胞系。

本发明提供的猪圆环病毒2型高敏感细胞系，其特征在于：

用RNA干扰技术沉默PK-15细胞中与PCV2感染密切相关的HMGCR基因，并获得稳定细胞系，利用此细胞系培养PCV2病毒，可使病毒TCID50达到10^8-9/mL。

本发明公开了一种真核表达载体pGPH1/GFP/Neo siRNA-HMGCR，用于构建HMGCR基因沉默的细胞系：

本发明构建的真核表达载体pGPH1/GFP/Neo siRNA-HMGCR是在pGPH1/GFP/Neo siRNA表达载体的基础上，插入人工合成的shRNA片段而成。

本发明还提供了用于沉默PK-15细胞的HMGCR基因的shRNA，其序列为：

Sense：

5'-caccgcagaaactgacacctcaagcttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3'；

Antisense：

5'-gatccaaaaaagcagaaactgacacctcaagctctcttgaagcttgaggtgtcagtttctgc-3'；

同时设有阴性对照shRNA，其序列为：

Control Sense：

5'-caccgttctccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3'；

Control Antisense：

5'-gatccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgacgtgacacgttcggagaac-3'。

本发明所述猪圆环病毒2型高敏感细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1）HMGCR基因沉默载体的制备

1.1）用于HMGCR基因沉默的shRNA序列：根据猪PK-15细胞的HMGCR基因序列特点，设计用于HMGCR基因沉默的shRNA，

其序列为：

Sense：

5'-caccgcagaaactgacacctcaagcttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3'；

Antisense：

5'-gatccaaaaaagcagaaactgacacctcaagctctcttgaagcttgaggtgtcagtttctgc-3'；

同时设有阴性对照shRNA，其序列为：

Control Sense：

5'-caccgttctccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3'；

Control Antisense：

5'-gatccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgacgtgacacgttcggagaac-3'。