[发明专利]一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及靶DNA片断的检测技术，具体涉及一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒及用该试剂盒检测舒伯特气单胞菌的方法。

背景技术

舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)属气单胞菌科(Aeromonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas)，为革兰氏阴性杆菌，单极鞭毛，运动极为活泼。该菌广泛存在于淡水、海水、土壤、鱼类和脊椎动物肠道中，人类接触后可引起感染，是急性腹泻的重要致病菌。然而有关该菌的检测试剂盒和检测技术虽已有专利申请（申请号：201210467910.1，名称：“一种致病性鳢源舒伯特气单胞菌的双重PCR检测引物组、试剂盒及方法”）披露，但该申请的试剂盒和检测技术仅适用于“鳢源舒伯特气单胞菌”，对其它宿主来源的舒伯特气单胞菌并不都能准确检测，根据对该申请的核心检测引物“gyrB引物对”的分析发现，该引物对与部分水产动物来源的舒伯特气单胞菌对应基因不能很好的匹配，如GeneBank数据库中的HQ731455、HQ731454、HQ731457、JQ319030。而本发明的核心引物组对所有已公布序列的舒伯特气单胞菌对应基因序列特异并完全弥合。因此本发明根据舒伯特气单胞菌基因组中特异保守区域设计适用于组装试剂盒的引物，并结合组织和细菌基因组提取试剂建立了舒伯特气单胞菌检测试剂盒，弥补了该技术领域不能解决对所有来源舒伯特气单胞菌检测的缺陷。本发明的试剂盒和检测方法的建立为水产动物舒伯特气单胞菌的快速诊断和病原调查提供了技术支撑。

发明内容

为解决传统的舒伯特气单胞菌鉴定方法费时、准确率低的问题，本发明提供一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒及其检测方法。根据舒伯特气单胞菌基因组保守区设计特异性引物，运用两步法PCR技术研制舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒和检测方法。该方法不但具有检测效率性，更具有检测的特异性，对同属的其它气单胞菌无交叉反应，扩增目的片段大小适中，检测技术中PCR程序的退火和扩增同时进行，大大降低了反应时间，并增加了反应特异性。该试剂盒可以以组织样品初提的DNA为起始物进行检测，利于临床试剂盒的应用。这也弥补了现今缺乏普适性的舒伯特气单胞菌检测试剂盒的空白。

为解决上述问题，本发明包括一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒以及用该试剂盒检测舒伯特气单胞菌的方法。

本发明一种舒伯特气单胞菌快速检测试剂盒，由DNA提取试剂和PCR反应试剂组成，其特殊之处是所述DNA提取试剂和PCR反应试剂分别为：

（1）DNA提取试剂成分为5-15mM Tris、0.5-1.5mM EDTA的pH8.0的TE缓冲液；蛋白酶K，浓度15-20mg/mL；100%的氯仿；100%的异丙醇；乙醇，浓度70%；双蒸水；

（2）PCR反应试剂分装于若干反应管，每个PCR反应管中含有10×PCR反应缓冲液2.5μL，浓度为10μM的dNTPs0.5μL，浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶0.3μL，浓度为10μM的特异性寡核苷酸引物A0.5μL，10μM的特异性寡核苷酸引物B0.5μL，灭菌去离子水19.2μL，其中——

引物A：5’-CAGCGAGGAGGAAAGGTTGGTGGT-3’，

引物B：5’-AAGCCACGCCTCAAGGGCACAA-3’。

本发明用所述的试剂盒检测舒伯特气单胞菌的方法，步骤为：（1）用所述提取试剂提取样品中的DNA；（2）用所述反应试剂对所述DNA作PCR扩增；（3）所述扩增产品作凝胶电泳；其特殊之处是所述PCR扩增过程为95℃预变性3min；98℃变性10s，68℃复性延伸30s，循环35次；最后72℃延伸5～10min；所述凝胶电泳后观察到413bp扩增产物。

本发明中所设计的舒伯特气单胞菌特异性检测引物，是根据GenBank中气单胞菌属25个种的对应基因组序列，以及所有已公布基因组序列的18株舒伯特气单胞菌，进行序列相似区比对和排列，寻找针对舒伯特气单胞菌核苷酸序列保守区域和位点作为引物设计区，设计对舒伯特气单胞菌特异的引物(引物A和引物B)。国内外尚未见对所有来源舒伯特气单胞菌特异检测引物设计的研究报道。