[发明专利]家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒及应用，属于生物技术领域。

背景技术

鼻出血有多种病因，可分为局部原因和全身原因。局部原因有外伤、鼻中隔偏曲、鼻腔鼻窦鼻咽的肿瘤、鼻腔特殊性传染病、鼻腔异物；全身原因有急性发热性传染病、心脏及循环系统疾病、出血性疾病、肝肾疾病、遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT）。其中唯一可家族遗传的就是遗传性出血性毛细血管扩张症。

遗传性出血性毛细血管扩张症是常染色体显性遗传的血管性疾病，在北美的发病率达1:5-8000，表现为皮肤黏膜毛细血管扩张和脏器动静脉畸形。鼻出血和胃肠道出血是黏膜受累的常见并发症。受累的脏器包括肺脏，肝脏和大脑。HHT是发育疾病，严重患病的婴幼儿较少，大部分患者的症状随年龄增长逐渐表现，因此直至其成年期才能做出正确诊断。最常见的临床症状为自发性反复性鼻出血，平均发病年龄为12岁。肺脏、肝脏和大脑的血管畸形可引起突发出血或血流短路，危及生命。HHT的治疗主要是对症治疗，对于顽固性出血患者尚无有效治疗手段，突然发病患者唯有通过早期确诊，定期监测，早期干预以避免严重并发症。HHT的临床诊断主要依据临床表现：鼻出血，皮肤黏膜的毛细血管扩张，内脏的动静脉畸形和家族史。分子诊断根据ENG基因、ACVRL1基因和SMAD4基因的筛查结果，临床确诊病人的突变检出率为80%-87%，且基因检测不受年龄及临床表现的限制，可实现早期诊断。

ENG基因位于9号染色体，编码的Endoglin蛋白为血管内皮的主要糖蛋白；其同型二聚体与TGFBR1（转化生长因子β的Ⅰ型受体）和/或TGFBR2（转化生长因子的βⅡ型受体）形成复合受体，与TGFB1和TGFB3有很强的亲和性，参与TGF-β/BMP（骨生成蛋白）信号通路。在内皮细胞与整合蛋白和/或其他RGD受体的结合中可能起关键作用，调节血管发育生成。基因变异可导致遗传性出血性毛细血管扩张症。

ACVRL1基因位于12号染色体，编码ALK1蛋白。ALK1蛋白属于TGF-β家族的I型受体，位于细胞表面，在丝氨酸-苏氨酸激酶亚区、甘氨酸-丝氨酸富集区、多肽C尾部高度保守。TGF-β的I型受体与BMP9/GDF2和BMP10结合，再形成I-II型受体复合物，自动磷酸化后结合并激活SMAD，在转录调节中发挥作用，主要是调节血管的生成。ALK1蛋白可调节血管内皮细胞的增殖和胚胎发育。ACVRL1基因突变或缺陷，可导致多种疾病，有遗传性出血性毛细血管扩张症、动静脉畸形、血管疾病等。

SMAD4基因位于18号染色体，编码蛋白属于信号传导蛋白Smad家族中一员。co-SMAD是TGF-β信号通路的辅助激活物和调节剂，在细胞核中可形成SMAD2/SMAD3-SMAD4复合物，有利于SMAD2/SMAD4/FAST-1与DNA结合，激活转录。该基因的突变或缺失可导致胰腺癌、幼年性息肉病合并HHT、肺动脉高压等。

国外报道HHT患者中ENG基因、ACVRL1基因和SMAD4基因所占比例分别为39%-59%、25%-57%、1%-2%。对这3个致病基因联合筛查，可提高HHT患者致病突变的检出率，基因诊断的灵敏性大大提高，实现早期诊断，预防严重并发症。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒及应用，本试剂盒检测顽固性鼻出血致病基因ENG、ACVRL1和SMAD4上的相关位点是否发生突变，可应用于临床和实验室筛查，实现HHT基因检测的快速、准确，本试剂盒灵敏性及特异性均较佳，有利于早期诊断。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒，其含有检测ACVRL1基因、ENG基因和SMAD4基因编码区突变的34对特异性引物，所述引物如SEQ ID NO：1～68所示：

表134对引物序列表

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述家族性遗传性鼻出血致病基因突变检测试剂盒还包括：dNTP混合液、TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCL₂溶液、去离子水的PCR反应体系。本发明所用试剂均为常规PCR反应试剂，本试剂盒的组分和含量包括：

（1）2.5ul   10XPCR缓冲液