[发明专利]表达猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体重组腺病毒组及其制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术与动物疫病防控领域，具体涉及表达猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体重组腺病毒的制备方法与应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是猪的一种高度接触性传染病，以母猪繁殖障碍和各种年龄猪呼吸道症状为主要特征。该病首次于1987年在北美发生，1996年传入我国，给世界养猪业造成巨大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）主要感染猪的单核-巨噬细胞系统，导致严重的细胞凋亡和免疫抑制，并能引起持续性感染。另外，该病毒不仅毒株多、变异快，还利用多种机制逃逸宿主的先天性和获得性免疫应答，包括抑制干扰素应答、干扰抗原提呈、抗体依赖的感染促进作用、减少感染细胞表面病毒抗原表达和中和表位遮蔽。因此，现有疫苗的免疫保护效果欠佳（灭活苗）或有散毒、毒力返强风险（弱毒苗），新型疫苗研制又面临巨大挑战，迫切需要研究防控该病的新策略。

PRRSV利用受体依赖的胞吞机制进入靶细胞，参与巨噬细胞感染的受体至少有三个，包括非特异吸附因子硫酸乙酰肝素、吸附与进入受体唾液酸粘附素（Sn）和脱衣壳受体CD163。其中，Sn前4个免疫球蛋白样结构域（Sn4D）参与病毒的吸附，CD163的第5个清道夫受体半胱氨酸富含（SRCR）结构域参与病毒的结合，但需要第6-9个SRCR结构域存在才具有受体功能，这些病毒结合结构域可以作为游离受体阻断病毒感染。

与容易变异的病毒蛋白不同，病毒受体是宿主细胞编码的保守分子，因此可作为阻断病毒感染的理想靶点，尤其是对容易变异的RNA病毒。其中，游离受体能与细胞受体竞争结合病毒，所以能中和或抑制病毒感染，并在抗麻疹病毒、禽白血病病毒和柯萨奇病毒等病毒中得以证实。据报道，由Sn4D和人IgG Fc片段组成的游离受体可部分抑制PRRSV感染，但人IgG Fc片段对猪有免疫原性，所用的游离受体从重组质粒转染细胞提取，因此猪体内使用受到限制。更为重要的是，PRRSV至少使用两个特异受体感染巨噬细胞，单个游离受体不足以阻断该病毒感染。至于CD163游离受体及其对PRRSV感染的阻断作用，目前尚无报道。

发明内容

本发明用重组腺病毒表达PRRSV游离受体Sn4D-Fc和SRCR59-Fc，经融合蛋白处理病毒和重组病毒转染细胞证明，两个游离受体的共同作用能显著抑制不同毒株PRRSV感染。该重组腺病毒可用较成熟的技术进行批量制备，能在注射猪体内持续表达，但不能在猪体内扩散传播，因此可作为防治PRRSV的新型制剂进行开发。

表达PRRSV游离受体的重组腺病毒组，是由表达Sn4D-Fc和SRCR59-Fc融合蛋白的重组腺病毒组成。即由表达猪唾液酸粘附素前4个IgV结构域和与猪IgG Fc片段融合蛋白的重组腺病毒，及表达脱衣壳受体CD163第5-9个SRCR结构域与猪IgG Fc片段融合蛋白的重组腺病毒组成。

本发明还公开了上述表达PRRSV游离受体的重组腺病毒组在制备防治猪繁殖与呼吸综合征制剂中的应用。

其中，所述PRRSV游离受体的重组腺病毒组通过下述方法制备:

1.用化学合成法合成猪IgG重链信号肽序列，用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增猪IgG Fc片段、唾液酸粘附素前4个IgV结构域（Sn4D）和CD163第5-9个结构域（SRCR59）编码序列。

2.将Sn4D与Fc融合序列插入腺病毒载体pShuttle-CMV，获得重组载体pShuttle-Sn4D-Fc；将猪IgG信号肽、SRCR59与Fc融合序列插入腺病毒载体pShuttle-CMV，获得重组载体pShuttle-SRCR59-Fc。

3.用重组载体pShuttle-Sn4D-Fc和pShuttle-SRCR59-Fc转染AAV-293细胞，获得重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59-Fc。

4.用AAV-293细胞扩增重组腺病毒。

与现有的PRRS疫苗相比，本发明制备的重组腺病毒为复制缺陷性病毒，不存在散毒或毒力返强等风险，而且能在注射猪体内持续表达，表达的游离受体对不同毒株PRRSV感染具有稳定的抑制作用。

附图说明