[发明专利]一种ApoB100酵母重组疫苗及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种ApoB100酵母重组疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

在21世纪，心脑血管疾病已经成为人类健康的第一杀手，动脉粥样硬化(atheroma)是一组称为动脉硬化的血管病中常见的最重要的一种，多由脂肪代谢紊乱、神经血管功能失调引起，是由遗传、环境等多因素导致的老年多发性疾病，常导致血栓形成、供血障碍等，近年来有逐渐年轻化和上升趋势。在众多的发病因素中，脂质代谢紊乱，尤其是高胆固醇血症与其关系最为密切。

脂蛋白在人类动脉粥样硬化(As)形成及进展过程中起主要作用，它是由脂质及载脂蛋白(Apo)构成。载脂蛋白在脂蛋白的代谢过程中起关键作用，主要分为A、B、C、D、E五类。载脂蛋白E是血浆脂蛋白的重要成分，它的主要机能是作为乳糜微粒(cM)残粒受体和低密度脂蛋白(LDL)受体的配体，在脂质残粒的代谢中起重要作用，对脂质的运输和代谢发挥主要作用。有研究表明，载脂蛋白E（ApoE）基因缺陷小鼠无论正常或者高脂饮食均可形成严重的高血脂症及AS，其病变的发展同人类极其相似，故常被用于研究AS发病机制以及抗AS病理学研究。载脂蛋白B（ApoB）为人体主要的载脂蛋白，为乳糜微粒（CM）、及低密度脂蛋白（VLDL）、中间密度脂蛋白、低密度脂蛋白（LDL）的构成成分，在脂类转运和代谢过程中起着极其重要的作用。人体含有两型ApoB分子，ApoB100参与VLDL的装配与分泌。在血液中，VLDL可代谢转化为富含胆固醇的LDL。每个LDL颗粒上仅含一分子ApoB100，是唯一的蛋白成分，同时也介导80%的LDL与受体结合使之被清除体外。ApoB48为CM合成和分泌所必需，参与外源性脂质的消化、吸收和运输。目前ApoB已被锁定为促使动脉粥样硬化（AS）与冠心病（CAD）的危险因子。

已研究发现免疫反应与动脉粥样硬化的发病相关,因此使用免疫抑制以及接种疫苗成为治疗动脉粥样硬化的新方法。许多研究证实,大部分免疫抑制药物对心血管的危险因素(包括血脂异常、高血压病、糖尿病)均有负面作用。因此,限制了该类药物在抗动脉粥样硬化上的应用。免疫接种常用的方法就是通过接种疫苗,暴露抗原诱导机体免疫反应,产生抗体。最近,临床上正在尝试使用免疫接种疫苗的方法治疗非感染性疾病,包括风湿性关节炎、I型糖尿病和Alzheimer’s病等。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种ApoB100酵母重组疫苗及其制备方法和应用，通过基因工程发酵酵母疫苗递呈抗原ApoB100，诱导机体产生特异性抗体，有助于动脉粥样等慢性炎症性疾病的防治。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种ApoB100酵母重组疫苗，该酵母重组疫苗以酵母作为宿主细胞，转染包含ApoB100基因片段的真核表达载体。

所述的ApoB100基因片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的真核表达载体为JMB88-HA-OVA-hApoB100，是将ApoB100基因片段克隆到JMB88-HA-OVA-MCS载体中的OVA的下游而得到的；

所述的酵母为酵母JMY1。

该酵母重组疫苗能够表达OVA-ApoB100融合蛋白，并将表达的ApoB100肽递呈给抗原递呈细胞，诱导免疫反应，产生针对ApoB100的抗体。

该酵母重组疫苗能够表达ApoB100肽，并将表达的ApoB100肽递呈给抗原递呈细胞，诱导免疫反应，产生针对ApoB100的抗体。

一种真核表达载体，该真核表达载体为JMB88-HA-OVA-hApoB100，是将ApoB100基因片段克隆到JMB88-HA-OVA-MCS载体中而得到的。

一种ApoB100酵母重组疫苗的制备方法，包括以下操作：

1）以人基因组为模板克隆ApoB100基因片段，并将ApoB100基因克隆到真核表达载体JMB88-HA-OVA-MCS当中，构建真核表达载体JMB88-OVA-hApoB100；

2）将真核表达载体JMB88-OVA-hApoB100转染到酵母菌株当中，并筛选阳性克隆；

3）将阳性克隆接种到液体SD培养基中，当细胞最佳密度达到OD₆₀₀=0.5时加入0.5mM的硫酸铜溶液进行诱导表达；

4）诱导表达后离心收集酵母细胞并进行洗涤，然后将酵母细胞在56℃灭活1h，得到ApoB100酵母重组疫苗。