[发明专利]一种异源精子诱导泥鳅雌核发育四倍体鱼苗的方法

说明书

技术领域

本发明属于异源精子诱导泥鳅雌核发育领域，具体涉及一种异源精子诱导泥鳅雌核发育四倍体鱼苗的方法。

背景技术

雌核发育是鱼类单性生殖中的一种重要的生殖方式，即用遗传失活的精子去激活成熟的卵子发育，精子进入卵后不进行雄核与卵核融合，只起到激活卵子开始发育的作用，然后诱导雌核二倍化得到基因纯合型鱼。人工雌核发育在鱼类纯系的快速建立、性别决定和性别的人为控制以及基因图谱的建立等方面都有十分重要的意义。一次人工诱导雌核发育的纯度约相当于14个世代全同胞交配选育的结果，任何鱼类经过连续两次雌核发育就可以作为纯系亲本用于育种生产（Chen等，2009）。因此，人工雌核发育成为鱼类遗传育种工程中的一个热点。

泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）是我国常见的小型淡水鱼类，其肉质细嫩、味美，营养丰富，且具有较高的药用价值，被誉为“水中人参”。近年来，泥鳅的市场需求量日益增加，然而，由于多年的过度捕捞，加上天然水域生态环境日益恶化，我国野生泥鳅的资源量正面临枯竭的危险。自上世纪90年代开始，泥鳅的繁育和养殖业在我国逐步得到发展，目前，已成为我国重要的水产经济鱼类。泥鳅作为我国新兴起的一种小型经济鱼类，具有广阔的发展前景。因此，泥鳅的遗传育种研究具有重要的经济意义。

已有的研究结果表明，泥鳅的染色体存在广泛的核型多态性，我国的野生泥鳅群体中不仅存在二倍体；在长江流域，研究人员还发现有大量四倍体的存在。四倍体泥鳅的体型明显大于二倍体，具有显著性的生长优势。四倍体泥鳅是我国特有的种质资源，为泥鳅的育种及相关领域的研究提供了理想的原材料。然而，目前利用天然四倍体泥鳅进行的雌核发育研究主要集中在日本，并且这些研究几乎都是采用紫外线灭活同源精子，然后激活卵子的方法来展开的。尽管研究人员对雌核发育关键技术（精子染色体的遗传灭活以及卵子染色体的二倍化）条件的摸索和方法的优化做了大量的工作，但是雌核发育技术还存在雌核发育鱼存活率低的问题，并且对雌核发育鱼的鉴定比较复杂。

已有实验证明远缘激活源不仅能提高雌核发育鱼的成活率，还能极大简化雌核发育鱼的鉴定问题。因为即使精子遗传物质不能被全部灭活，杂交的后代也不会成活，能存活的个体也很容易与母本区别开。团头鲂（Megalobrama amblycephala）精子就是一种诱导鱼类雌核发育较好的远缘激活源。利用团头鲂精子诱导天然四倍体泥鳅的卵子雌核发育，并进行染色体操作的研究，目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种异源精子诱导泥鳅雌核发育四倍体鱼苗的诱导方法，方法简单，易行，利用本发明的方法，其受精率，孵化率和存活率均有很大的提高。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种异源精子诱导泥鳅雌核发育四倍体鱼苗的诱导方法，其步骤如下：

A、亲本的选取与人工催产

选择体形正常、外表无伤、体质健壮、腹部膨大有弹性、卵巢轮廓明显的四倍体雌性泥鳅。雄性团头鲂要求胸鳍珠星明显、有粗糙感、轻压腹部有白色精液从生殖孔流出。

B、精子的遗传灭活

采集团头鲂精子，镜检选取活力在90%以上的用于紫外线灭活，团头鲂精液1ml，用Hank’s溶液按照1:4体积比稀释，置于经预冷的干燥培养皿（直径75mm）中，精液厚度约为0.1-0.2mm，然后置于2支15W紫外灯下处理。灯管与静液面距离10-12mm，灭活时间20-25min，精子的活力水平下降到30%时，停止光照。处理过的精液置于4℃冰箱中，避光保存备用。

C、团头鲂精子诱导泥鳅雌核发育

将稀释的精液200-600μL加入到含5-30ml四倍体泥鳅未受精卵的瓷盆中，混合均匀，随后加入5-10ml7%（w/v）生理盐水，继续混匀后，加入50-200ml曝气水。

D、冷休克处理：

采用0-4℃冰水混合物在授精后2-10min进行冷休克处理，处理持续时间20-55min。

最佳的冷处理条件为：0-4℃冰水混合物在授精后7-8min进行冷休克处理，处理持续时间30min。

F.孵化

受精卵经冷休克处理后，转移至23℃的水浴中复温。最后在曝气水中孵化。

所述的曝气水为水温23-25℃，溶氧6.0-7.0mg/L，pH值在7.8-8.2的自来水。

采用以下两种方法进行泥鳅雌核发育四倍体鱼苗的鉴定：

A、流失分析和染色体分析鉴定雌核发育四倍体鱼苗