[发明专利]一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法

权利要求书

1.一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于它是按以下步骤进行：

步骤一：将经酸化处理的多壁碳纳米管与离子液体研磨混合20-30min，直至形成均匀的电极修饰液，按0.01-0.07uL/mm²的滴涂量将电极修饰液均匀涂敷于玻碳电极表面，室温下干燥，即得纳米复合工作电极；其中，碳纳米管与离子液体的质量体积比为1mg:（15μL-25μL）；

步骤二：按4.5×l0⁴-5.5×l0⁴个/cm²的接种量将模型细胞接种于含0.2-0.25mL/cm²DMEM细胞完全培养液的n个培养皿中，放于37℃、CO₂体积百分含量为5%培养箱中培养48h-50h后，取出培养皿，弃去DMEM细胞完全培养液，用pH=7.0-7.4的PBS缓冲溶液漂洗；然后每个培养皿中按21-24μL/cm²的加入量加入pH=7.0-7.4的PBS缓冲溶液，在45-55℃水浴中原位裂解细胞25-35min，获得细胞裂解液；

步骤三：用步骤一制备的纳米复合工作电极分别检测嘌呤碱基单体溶液、嘌呤碱基混合溶液和步骤二中得到的细胞裂解液的电化学信号，确定细胞裂解液的电化学信号中嘌呤碱基电化学信号所在的峰位；其中，纳米复合工作电极工作条件为温度25℃、pH=7.2、扫描速度100mv/s；所述的嘌呤碱基单体为鸟嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤或次黄嘌呤中的一种，嘌呤碱基单体溶液浓度为5×10-⁶-9×10-⁶M，溶剂为pH=7.0-7.4的PBS缓冲液；嘌呤碱基混合液由各嘌呤碱基单体和pH=7.0-7.4的PBS缓冲液混合制成，各嘌呤碱基单体在混合液中的终浓度均为5×10^-6-9×10^-6M；

步骤四：按4.5×l0⁴-5.5×l0⁴个/cm²的接种量将模型细胞接种于含0.2-0.25mL/cm²DMEM细胞完全培养液的n个培养皿中，放于37℃、CO₂体积百分含量为5%培养箱中培养24-26h后，弃去DMEM细胞完全培养液，然后将n个培养皿随机均分成二组，一组加入含有质量百分含量为0.03-0.13%的致突变剂的无血清DMEM培养液对细胞进行培养1-3h，做为加药组；另一组用含有0.1%-0.5%DMSO的无血清DMEM培养液对细胞进行培养1-3h，做为阴性对照组；其中，二组无血清DMEM培养液的加入量均为0.2-0.25mL/cm²；

步骤五：将步骤四的两组培养的细胞用缓冲液分别冲洗2-3次，然后加入DMEM完全培养液培养，放于37℃、CO₂体积百分含量为5%的培养箱中培养7-9天，每12h或24h进行电化学检测，然后以电化学检测时间为横坐标，以在步骤三中嘌呤碱基电化学信号所确认的峰位对应的电压下所测得的基因突变前和突变过程中细胞嘌呤核苷酸代谢电流信号为纵坐标，建立HGPRT基因突变电化学信号变化规律图，即完成一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法；其中，DMEM细胞完全培养液加入量为0.2-0.25mL/cm²。

2.根据权利要求1所述的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于步骤一中所述的碳纳米管与离子液体的质量体积比为1mg:20μL。

3.根据权利要求1所述的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于步骤二中所述的原位裂解细胞加入的PBS缓冲溶液的加入量为24μL/cm²，pH=7.4，裂解温度为50℃，时间为30min。

4.根据权利要求1所述的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于步骤三中所述的嘌呤碱基单体浓度均为8×10^-6M，各嘌呤碱基单体在混合液中的终浓度均为8×10^-6M。

5.根据权利要求1所述的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，其特征在于步骤四中所述的致突变剂为ENU或EMS，质量百分含量均为0.06%，DMSO质量百分含量为0.1%。