[发明专利]一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种哺乳类动物细胞株基因突变的电化学检测方法，尤其涉及对核糖转移基酶基因位点的基因突变电化学检测。

背景技术

哺乳动物细胞致突变试验是国际评价致突因素的重要传统方法，它以哺乳动物细胞为材料，通过检测细胞中特定基因的突变确定受试物的致突性。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移基酶（HGPRT）基因是理想的突变生物标志物，它作为内源性结构基因，编码产生嘌呤代谢补救途径的关键酶，因其具有对各种致突因素敏感、自发突变率低等优点，已成为基因突变研究中的重要靶基因。在哺乳动物细胞HGPRT基因突变试验中，HGPRT基因突变会引发嘌呤代谢补救途径中的关键酶—HGPRT活性下降甚至消失，引起相关通路中核苷酸代谢异常，进而导致嘌呤碱基及尿酸含量关系发生特征性变化。因而，如果能够实时跟踪检测这种变化，必然可以及时反映HGPRT基因位点突变情况。

目前，对传统的哺乳动物细胞株基因突变的检测方法仅能通过检测遗传学终点来确定基因突变结果，周期较长，一般需要15天以上，易造成假阴性结果，而且手段繁复，费用高、误差大。另外，试验中需要荧光和放射性标记，会对试验人员健康造成伤害。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有方法在检测传统的哺乳动物细胞株基因突变时仅能通过检测遗传学终点来确定基因突变结果，周期长，手段繁复，费用高、误差大，易出现由于表达不完全而造成的假阴性结果，而且试验中需要荧光和放射性标记，会对试验人员健康造成伤害的问题，而提供的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法。

本发明的一种核糖转移基酶基因突变的电化学检测方法，它是按以下步骤进行：

步骤一：将经酸化处理的多壁碳纳米管与离子液体研磨混合20-30min，直至形成均匀的电极修饰液，按0.01-0.07uL/mm²的滴涂量将电极修饰液均匀涂敷于玻碳电极表面，室温下干燥，即得纳米复合工作电极；其中，碳纳米管与离子液体的质量体积比为1mg:（15μL-25μL）；

步骤二：按4.5×l0⁴-5.5×l0⁴个/cm²的接种量将模型细胞接种于含0.2-0.25mL/cm²DMEM细胞完全培养液的n个培养皿中，放于37℃、CO₂体积百分含量为5%培养箱中培养48h-50h后，取出培养皿，弃去DMEM细胞完全培养液，用pH=7.0-7.4的PBS缓冲溶液漂洗；然后每个培养皿中按21-24μL/cm²的加入量加入pH=7.0-7.4的PBS缓冲溶液，在45-55℃水浴中原位裂解细胞25-35min，获得细胞裂解液；

步骤三：用步骤一制备的纳米复合工作电极分别检测嘌呤碱基单体溶液、嘌呤碱基混合溶液和步骤二中得到的细胞裂解液的电化学信号，确定细胞裂解液的电化学信号中嘌呤碱基电化学信号所在的峰位；其中，纳米复合工作电极工作条件为温度25℃、pH=7.2、扫描速度100mv/s；所述的嘌呤碱基单体为鸟嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤或次黄嘌呤中的一种，嘌呤碱基单体溶液浓度为5×10^-6-9×10^-6M，溶剂为pH=7.0-7.4的PBS缓冲液；嘌呤碱基混合液由各嘌呤碱基单体和pH=7.0-7.4的PBS缓冲液混合制成，各嘌呤碱基单体在混合液中的终浓度均为5×10^-6-9×10^-6M；

步骤四：按4.5×l0⁴-5.5×l0⁴个/cm²的接种量将模型细胞接种于含0.2-0.25mL/cm²DMEM细胞完全培养液的n个培养皿中，放于37℃、CO₂体积百分含量为5%培养箱中培培养24-26h后，弃去DMEM细胞完全培养液，然后将n个培养皿随机均分成二组，一组加入含有质量百分含量为0.03-0.13%的致突变剂的无血清DMEM培养液对细胞进行培养1-3h，做为加药组；另一组用含有0.1%-0.5%DMSO的无血清DMEM培养液对细胞进行培养1-3h，做为阴性对照组；其中，二组无血清DMEM培养液的加入量均为0.2-0.25mL/cm²；