[发明专利]一种脱氮复合菌剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种脱氮复合菌剂，其特征在于，包括：

CPZ24(Rhodococuus pyridinivorans)    1×10⁸-10×10⁸cfu/mL；

CPZ56(Shinella zoogloeoides)          1×10⁸-10×10⁸cfu/mL；

WL12(Pseudomonasspp.)              1×10⁸-5×10⁸cfu/mL。

2.根据权利要求1所述的脱氮复合菌剂，其特征在于，由如下组成：

CPZ24(Rhodococuus pyridinivorans)    1×10⁸-8×10⁸cfu/mL；

CPZ56(Shinella zoogloeoides)          1×10⁸-8×10⁸cfu/mL；

WL12(Pseudomonasspp.)              1×10⁸-4×10⁸cfu/mL。

3.权利要求1或2所述脱氮复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）固体斜面培养：将CPZ24、CPZ56、WL12分别接种于固体培养基上，于30℃无菌环境下培养1-3天，使菌株活化；

2）一级种子培养：将步骤1）活化的菌株，在无菌条件下分别接种于液体培养基中，均于30℃，150-180rpm下培养2-3天时，单菌种液体培养OD₆₀₀值达到2.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子；

3）二级种子培养：按液体培养基的体积比为10-20%的接种量，将步骤2）所得一级种子分别接种于发酵罐中，30℃条件下，培养2-3天，制得二级种子；

4）混合发酵培养：按液体培养基的体积比为10-20%的接种量，将步骤3）得到的二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基；在步骤2）、步骤3）中，所述液体培养基为牛肉膏蛋白琼脂胨培养基。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤3）中，发酵培养条件：搅拌速度为100-200r/min，通气量为1：0.8-2。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤4）中，所述液体培养基的配方按质量百分比为：柠檬酸钠5-10%、葡萄糖2-10%、硫酸铵1.0-5%，余量为水。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤4）中，所述高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、柠檬酸钠、甘油中任一种或两种以上；氮源为：硫酸铵和/或蛋白胨。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤4）中，所述混合发酵培养为有氧培养：起始0-24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：0.8-1.5，调控发酵溶解氧10-15%，搅拌转速100-200r/min，搅拌间隔时间2-3小时，搅拌1-3分钟，温度25-35℃。

9.权利要求1或2所述脱氮复合菌剂在畜禽废水中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，具体应用方法为：按接种量4-6%比例将脱氮复合菌剂接种于畜禽废水中，同时加入50mg·L^-1葡萄糖补充各菌株生长所需碳源，30℃摇床培养，150-180rpm，120h。