[发明专利]VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导及复苏方法

权利要求书

1.一种VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导方法，其特征在于：该诱导方法包括如下步骤：

1）原始菌株的培养

将啤酒易感乳酸菌采用MRS固体培养基进行纯化复壮，挑取固体平板上较大的菌落接种于液体MRS培养基中培养；

2）采用低温储藏工艺进行VBNC状态菌的诱导

取耐乙酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）2011-8培养物放入冰箱内保存，并且每隔7天进行一次MRS平板计数，本试验重复三次且设定正常培养下的L.acetotolerans2011-8为对照组，直至平板25-28℃厌氧培养14天无单菌落出现，此时可认为该菌不可培养，下同；

3）VBNC状态菌的检测，该检测方法包括以下步骤：

a）首先测定细菌总数

将新鲜培养的菌液进行10倍系列稀释，取适当浓度的稀释液加终浓度2%的甲醛固定，再取1mL固定后的稀释液加吖啶橙溶液染色，再将黑色微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片上，取适量样品滴于滤膜上，待菌液略干盖上载玻片并压紧，在载玻片上滴一滴无自发荧光的香柏油，用荧光显微镜于暗室中观察并计数；

b）采用试剂盒检测细菌活性

取1mL计数平板上无单菌落存在的培养物于7000g离心5min，用无菌生理盐水洗涤两次，尽可能地除去细菌培养液，以免培养基产生自发光而干扰观察结果；再加入50μL的无菌蒸馏水重悬菌体沉淀，加入各25μL的绿色染料和红色染料，吹吸混匀后避光染色15-20min；取适量样品滴于无自发荧光的载玻片上，盖上载玻片，并在载玻片上滴1滴无自发荧光的香柏油，用荧光显微镜于暗室中观察并计数。

2.根据权利要求1所述的VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导方法，其特征在于：步骤1）中，所述培养是在25-28℃厌氧条件下培养3-5天。

3.根据权利要求1所述的VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导方法，其特征在于：步骤3）中，所述试剂盒由两种专染核酸染料组成：一种是绿色荧光染料SYTO-9，能渗入完整细胞膜结构的菌体内；一种是红色染料PI，仅能渗到细胞膜破损的菌体内，并且与SYTO-9竞争核酸着染位点。

4.一种VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导方法，其特征在于：该诱导方法包括如下步骤：

1）原始菌株的培养

将啤酒易感乳酸菌采用MRS固体培养基进行纯化复壮，挑取固体平板上较大的菌落接种于液体MRS培养基中培养；

2）采用啤酒内连续传代工艺进行VBNC状态菌的诱导

以步骤1）中的L.acetotolerans2011-8的培养物作为起始代（即0^#），取1mL的0^#培养物接种于10mL灭菌后的脱气啤酒中，25-28℃厌氧培养6天至出现絮状沉淀，即作为第1代（1^#）；再取1mL的1^#培养物接种于10mL灭菌后的脱气啤酒中，于25-28℃厌氧培养6天，另外吸取0.1mL的1^#培养物涂布于MRS固体平板上进行细菌计数，重复上述操作直至计数平板25-28℃厌氧培养14天无单菌落出现；

3）VBNC状态菌的检测，该检测方法包括以下步骤：

a）首先测定细菌总数

将新鲜培养的菌液进行10倍系列稀释，取适当浓度的稀释液加终浓度2%的甲醛固定，再取1mL固定后的稀释液加吖啶橙溶液染色，再将黑色微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片上，取适量样品滴于滤膜上，待菌液略干盖上载玻片并压紧，在载玻片上滴一滴无自发荧光的香柏油，用荧光显微镜于暗室中观察并计数；

b）采用试剂盒检测细菌活性

取1mL计数平板上无单菌落存在的培养物于7000g离心5min，用无菌生理盐水洗涤两次，尽可能地除去细菌培养液，以免培养基产生自发光而干扰观察结果；再加入50μL的无菌蒸馏水重悬菌体沉淀，加入各25μL的绿色染料和红色染料，吹吸混匀后避光染色15-20min；取适量样品滴于无自发荧光的载玻片上，盖上载玻片，并在载玻片上滴1滴无自发荧光的香柏油，用荧光显微镜于暗室中观察并计数。

5.根据权利要求4所述的VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导方法，其特征在于：步骤1）中，所述培养是在25-28℃厌氧条件下培养3-5天。