[发明专利]七鳃鳗李蛋白、制备方法及在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，尤其是一种能够特异性杀伤肿瘤细胞且具有一个凝集素结构域（Jacalin_like domain）和一个成孔毒素结构域（Pore-forming toxin_like domain）的七鳃鳗李蛋白、制备方法及在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用。

背景技术

世界卫生组织预计：至2030年全球每年的癌症死亡人数将可能在现有的基础上增加一倍，届时每年将有1700万人死于癌症。虽然人们对肿瘤发生和恶化的认识不断提高，也有大量文献报道在肿瘤治疗领域取得了一些重大突破，然而，至今仍然没有一种安全有效的药物用于肿瘤疾病的预防及治疗，因此肿瘤常被喻为“不治之症”。

七鳃鳗与盲鳗是现存最古老的脊椎动物，特殊的进化地位和独特的生活习惯造就了七鳃鳗独有的生命特征。七鳃鳗做为一种新的发育和进化生物学模式动物，最为代表性的特征是具有完善的适应性免疫系统，其核心免疫分子可变淋巴细胞受体几乎可以与有颌类脊椎动物的免疫球蛋白相媲美。七鳃鳗李氏小体位于七鳃鳗背部脊柱的正上方，由第三鳃孔起，终至第二背鳍前端。组织内有多种不同类型的细胞并含有丰富的脂肪成分，该组织分泌丰富的调节因子及其它功能蛋白，随血液循环运至全身。近年来大量实验数据表明，七鳃鳗李氏小体是免疫防御系统中最重要的免疫器官，尤其是在适应性免疫系统中发挥重要作用。但是，迄今为止没有关于从七鳃鳗李氏小体细胞培养液中分离得到的具有一个凝集素结构域（Jacalin_like domain）和一个成孔毒素结构域（Pore-forming toxin_like domain）蛋白及此蛋白应用于制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种能够特异性杀伤肿瘤细胞且具有一个凝集素结构域（Jacalin_like domain）和一个成孔毒素结构域（Pore-forming toxin_like domain）的七鳃鳗李蛋白、制备方法及在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用。

本发明的技术解决方案是：一种七鳃鳗李蛋白，其特征在于是从七鳃鳗李氏小体细胞培养液分离得到的蛋白，所述蛋白具有一个凝集素结构域（Jacalin_like domain）和一个成孔毒素结构域（Pore-forming toxin_like domain）。

上述七鳃鳗李蛋白的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a．取新鲜的李氏小体，放入胰蛋白酶中4℃过夜消化；

b. 收集消化后的细胞，PBS清洗两次；

c．转入无血清的1640培养液中培养72小时；

d. 收集七鳃鳗李氏小体细胞的培养液，加入终浓度为2 mmol/L的苯甲基磺酰氟；

e．以0.1 M KCl/ buffer A（20 mM KPB, 5% Glycerol, pH 7.0）为透析液，在4℃条件下对所收集的细胞培养液透析2 hr~O/N，共透析3次；

f．透析后的样品通过0.45μm滤膜过滤；

g. 将过滤后样品上样至柱体积为10 ml的Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I 80 μm羟基磷灰石吸附层析柱中，线性梯度洗脱 0～250 mM KPB pH7.0/0.1 M KCl / buffer A ，流速为1.0 ml/min，分管收集2.5 ml/管，共80管；

h．合并第8~23管洗脱液，置于1L buffer B（20 mM Tris-HCl, 5% Glycerol, pH 8.0）中4℃下透析，2 hr~O/N更换一次透析液，共透析3次； 

i．透析后的样品通过0.45 μm滤膜过滤；

j．取20 ml Q Sepharose  Fast Flow（购自GE Healthcare）填料灌装层析柱，用于对上一步样品进行离子交换层析，将过滤后样品全部上样，线性梯度洗脱 0～0.3 M KCL / buffer B ，流速1.0 ml/min，分管收集2.5 ml/管，80管；

k．收集29-35管，使用PBS透析2 hr~O/N，共透析3次，得到产物即为纯化的七鳃鳗李蛋白，具有一个凝集素结构域和一个成孔毒素结构域。

所述的七鳃鳗李蛋白在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用。