[发明专利]含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒、含该表达盒的微环DNA及应用

权利要求书

1.一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述微环DNA重组母质粒是在微环DNA空质粒的多克隆位点中插入重组嵌合抗原受体基因表达盒的基因序列组合而成，其中，所述微环DNA空质粒为p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒，所述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号。

2.如权利要求1所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述重组嵌合抗原受体基因具有编码重组嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；

所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：

肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。

3.如权利要求2所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所述铰链区为CD8α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。

4.如权利要求3所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述第一转导信号为免疫球蛋白FcεRI受体的γ链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二转导信号为CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的两种。

5.如权利要求4所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述抗CD19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二转导信号依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为CD3的ζ链，所述CD3的ζ链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.如权利要求3所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述CD8α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CD8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

7.如权利要求2所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。

8.如权利要求2所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。

9.如权利要求2所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表位。

10.如权利要求1所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述启动子和所述重组嵌合抗原受体基因之间连接有编码CD8信号肽的核苷酸序列，所述编码CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。