[发明专利]含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒、含该表达盒的微环DNA及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒及其构建方法和应用，和一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA及其构建方法和应用，一种具有含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的宿主细胞及其应用，以及一种重组嵌合抗原受体及其表达方法和应用。 

背景技术

临床上，重组嵌合抗原受体已被用来治疗各种疾病，包括癌症和自身免疫性疾病等。但是目前重组嵌合抗原受体一般是在体外生产后再注射到体内进行治疗，这种方式有多种缺点，比如：（1）生产、包装、运输、保存等环节花费大、成本高；（2）蛋白抗体药物纯度不高，污染物存在副作用，有安全隐患；（3）抗体的半衰期短，需反复注射，有时还需要用微泵给药法维持体内抗体的有效浓度，加大了抗体临床应用的难度，且治疗费用高昂。 

基因治疗采用基因转染的方式将治疗性基因转染到人体靶细胞，是避免直接注射蛋白抗体药物存在的问题的有效途径之一。在基因治疗中，采用有效的载体高效、安全地将目的基因转移至宿主细胞内表达非常重要，基因治疗载体有重组腺病毒载体、逆转录病毒载体和质粒载体。其中，病毒载体在体内的转染率高，但制备病毒载体的费用高昂，且病毒载体存在插入突变的风险和免疫原性，会带来诱癌风险并可能引发患者致命的免疫反应。传统的质粒载体比病毒载体安全，但比病毒载体的转染率低，且外源基因只能瞬时表达，如要稳定 持久地表达，载体必须整合到宿主细胞染色体上，而载体的随机整合会引起插入突变或导致外源基因的沉默，此外，传统质粒载体中含有细菌复制序列、抗性基因、未甲基化的CpG基序和一些可能隐藏的表达信号，这些序列在质粒复制时是必需的，但在基因治疗中可能引起严重的生物安全性问题。 

发明内容

鉴于此，本发明实施例第一方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，该微环DNA重组母质粒能在宿主菌内完成微环DNA的重组过程，消除原核质粒元件。 

本发明实施例第二方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒的构建方法。 

本发明实施例第三方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，该微环DNA可游离于宿主细胞基因组DNA之外稳定持久的表达重组嵌合抗原受体基因。 

本发明实施例第四方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的构建方法。 

本发明实施例第五方面提供了一种具有含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的宿主细胞。 

本发明实施例第六方面提供了一种重组嵌合抗原受体。 

本发明实施例第七方面提供了一种重组嵌合抗原受体的表达方法。 

本发明实施例第八方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒、含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA、具有含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的宿主细胞和重组嵌合抗原受体的应用。 

第一方面，本发明提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，所述微环DNA重组母质粒是在微环DNA空质粒的多克隆位点（MCS）中插入重组嵌合抗原受体基因表达盒的基因序列组合而成，其中，所述微环DNA空质粒为p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒，所述重组嵌合抗原受 体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号。 

优选地，所述重组嵌合抗原受体基因具有编码重组嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区； 

所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为： 

肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。 

其中，所述重组嵌合抗原受体为膜受体分子，其肿瘤细胞抗原表位的结合位点通过铰链区、跨膜区与胞内信号转导区依次相连；所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点具有结合肿瘤细胞抗原表位的能力，所述铰链区能让该膜受体分子的胞外区，即肿瘤细胞抗原表位的结合位点充分伸展，保持其肽段的功能完整性，从而充分行使识别、结合肿瘤抗原的功能；所述跨膜区为连接膜受体分子的胞外抗原识别亚单位和胞内信号转导亚单位的肽段；所述胞内信号转导亚单位的肽段具有信号转导激活基序。