[发明专利]一种原代鸡肝细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将取得的鸡肝脏使用添加有2%双抗的D-Hanks溶液浸泡冲洗后，灌注37℃预热的灌流液A8分钟-10分钟，然后灌注37℃预热的灌流液B5分钟-8分钟；其中，所述的灌流液A配方为：15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，并添加有0.6mM/L的EGTA及2%双抗，所述的灌流液B配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/LKCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，3mM/L CaCl₂，并添加有2%双抗；

步骤2：将肝脏转移到无菌的烧杯里，把烧杯浸泡在37℃-38℃恒温水浴锅中，用80mL37℃预热的灌流液C循环灌注消化20分钟-25分钟；所述的灌流液C的配方为：0.05g/L胶原酶，15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，3mM/L CaCl₂；

步骤3：将消化完毕的肝脏使用含2%双抗的D-Hanks溶液洗脱肝细胞，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到肝细胞；

步骤4：将分离得到的肝细胞使用无血清培养液稀释，并接入细胞板或细胞瓶培养；所述的无血清培养液配方为：基础培养液，0.5mg/L地塞米松，5mg/L转铁蛋白，0.5mg/L牛胰岛素，10μg/L亚硒酸钠，20μg/L肝细胞生长因子，1%的双抗，其中，所述的基础培养液选自Williams'medium E基础培养液、DMEM基础培养液、L-15基础培养液或1640基础培养液。

2.根据权利要求1所述的一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，其特征是：所述的步骤1中灌注灌流液A的速度为30mL/min，灌注灌流液B的速度为50mL/min，所述的步骤2中循环灌注灌流液C的速度为20mL/min。

3.根据权利要求1所述的一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，其特征是：所述的步骤1中灌流液A的pH为7.6，灌流液B的pH为7.6，所述的步骤2中的灌流液C的pH为7.4。

4.根据权利要求1所述的一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，其特征是：所述的无血清培养液配方中的基础培养液为Williams'medium E基础培养液。

5.根据权利要求1所述的一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，其特征是：所述的灌流液C配方中的胶原酶为IV型胶原酶或II型胶原酶。

6.根据权利要求5所述的一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，其特征是：所述的灌流液C配方中的胶原酶为IV型胶原酶。

7.根据权利要求1所述的一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，其特征是：所述的双抗为青霉素和链霉素。