[发明专利]一种原代鸡肝细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种原代鸡肝细胞的分离培养方法。

背景技术

利用原代肝细胞进行体外实验，与其他体外及体内实验方法相比，有自身显著的优点。原代培养的肝细胞不受体内神经内分泌系统的复杂影响，且能保持肝细胞的特异性功能，并维持对一些激素的反应性，因此，原代培养的肝细胞是研究肝脏物质代谢及其调节机制的极好模型。

肝细胞的分离最初采用的是离体灌流法。到1975年，Seglen采用原位两步胶原酶灌流法成功地分离得到高活率的大鼠肝细胞，1992年，Fraslin等对Seglen的原位两步灌流法进行改进，并应用于成年鸡肝细胞的分离，每只鸡的肝脏可获得0.5×10⁹-1×10⁹个肝细胞，细胞活率在75%-95%之间。同之前的肝脏离体灌流相比较，原位灌流由于鸡只的肝脏和心脏尚有一定血液循环能力，使得初步冲洗灌流液灌流效果好，不易凝血和出现灌流死角，所以鸡肝细胞的分离大多采用原位灌流方法。但是，原位灌流也存在一个巨大的问题，灌流肝脏始终处于开放的腹腔环境中，而鸡只又不可能完全无菌，这就导致肠道、羽毛及鸡只附带杂物等对肝脏灌流造成污染的风险，而细胞污染是所有细胞培养都要面临的棘手问题，细胞一旦污染，会严重影响细胞的正常生长和代谢。同时，胶原酶价格昂贵，每只鸡肝脏的消化灌流都要消耗几百毫升的胶原酶灌流液，导致灌流成本高昂。

另外，肝细胞的培养有赖于血清的存在，在普通培养液中，如不加血清，绝大部分肝细胞不能增殖。血清的主要作用在于提供细胞生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，维持细胞较好的生长状态，促进细胞的生长与分裂增殖。然而加入血清培养细胞也有其不利的方面：第一，血清成分非常复杂、不明确，在肝细胞培养中使用血清，会影响肝细胞基础代谢，对以肝细胞培养为基础的研究和生产造成影响；第二，血清中的某些生物活性物质会毒害肝细胞并干扰其生物转化；第三，血清可能带来病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；第四，血清中的某些蛋白会对生物测定产生干扰，不便于对实验结果的分析。而对于鸡肝细胞的无血清培养，国内尚未建立成熟的、培养时间长、稳定性高的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述技术现状，提供一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，降低鸡肝细胞分离过程的污染和灌流成本，同时，建立一种适于鸡肝细胞培养的无血清培养方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种原代鸡肝细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

步骤1：将取得的鸡肝脏使用添加有2%双抗的D-Hanks溶液浸泡冲洗后，灌注37℃预热的灌流液A8分钟-10分钟，然后灌注37℃预热的灌流液B5分钟-8分钟；其中，所述的灌流液A配方为：15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，并添加有0.6mM/L的EGTA及2%双抗，所述的灌流液B配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/LKCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，3mM/L CaCl₂，并添加有2%双抗；

步骤2：将肝脏转移到无菌的烧杯里，把烧杯浸泡在37℃-38℃恒温水浴锅中，用80mL37℃预热的灌流液C循环灌注消化20分钟-25分钟；所述的灌流液C的配方为：0.05g/L胶原酶，15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，3mM/L CaCl₂；

步骤3：将消化完毕的肝脏使用含2%双抗的D-Hanks溶液洗脱肝细胞，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到肝细胞；

步骤4：将分离得到的肝细胞使用无血清培养液稀释，并接入细胞板或细胞瓶培养；所述的无血清培养液配方为：基础培养液，0.5mg/L地塞米松，5mg/L转铁蛋白，0.5mg/L牛胰岛素，10μg/L亚硒酸钠，20μg/L肝细胞生长因子，1%的双抗，其中，所述的基础培养液选自Williams'medium E基础培养液、DMEM基础培养液、L-15基础培养液或1640基础培养液。