[发明专利]一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法

权利要求书

1.一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法，选择棉花主要病害的病原真菌，包括棉花黄萎病、枯萎病、立枯病、红腐病和红粉病所对应的病原菌大丽轮枝菌、黑白轮枝菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、串珠镰刀菌和粉红单端孢，并测定以上病原真菌的ITS序列；利用Webcutter在线分析选择酶切带谱类型各异的限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A，结合pDRAW32软件，对酶切产物分布情况进行分析，并绘制出2-4％的琼脂糖凝胶电子酶切图谱，作为比对使用的标准图谱；

随后提取待测棉花样品的病原真菌的基因组DNA，采用如下引物对所提取的DNA进行PCR扩增；

ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’：

ITS5：5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’：

扩增产物使用限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A分别酶切，并采用与前述琼脂糖凝胶相同浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，并将酶切结果和电子标准图谱比对，鉴定病原真菌种类。

2.根据权利要求1所述的快速鉴定方法，其特征在于所述的鉴定方法包括如下步骤：

1)DNA的提取：将分离纯化的棉花病原真菌接种至PDA培养基，28℃恒温静置培养，收集菌丝，收集棉花病原真菌的菌丝，采用CTAB-NaCl方法抽提，用ddH₂O溶解基因组DNA；

2)PCR扩增：以上述病原真菌的基因组DNA为模板，采用引物对ITS4 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’和ITS5 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’进行PCR扩增；20μl的PCR反应体系：包括10×PCR buffer(Mg²⁺)2μl，浓度为10mM的dNTP溶液1.6μl，浓度为10uM引物ITS4／ITS5各1μl，基因组DNA1μl，浓度为5U／μl的Taq酶0.2μl，以及13.2μl的ddH₂O；扩增反应程序为：94℃预变性2min，之后，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共25个循环，最后72℃延伸10min，得到ITS的PCR产物，产物大小为500-750bp；

3)酶切反应：任意使用限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A对ITS的PCR产物酶切；10μl的酶切体系：ITS模板6μl，10×内切酶buffer1μl，内切酶0.5μl、ddH₂O2.5μl；反应条件为：PCR仪中37℃保温1h，加入2μl的6×loading buffer终止反应，3％琼脂糖凝胶电泳恒压75V，2小时，在紫外灯下观察拍照，获得ITS-RFLP带谱；

4)带谱鉴别：将上述获得的ITS-RFLP带谱和标准电子酶切图谱比对，首先比对HhaI和Sau3A对应的大小和电子图谱。