[发明专利]一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病理学领域，具体地，本发明涉及一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法。 

背景技术

棉花是世界性重要的经济作物和纺织工业原料，也是关系国计民生的重要物资。长期以来，棉花病虫害的普遍发生始终是制约棉花高产的瓶颈问题，其中最为严重的当属黄萎病和枯萎病，其次为铃病和苗病，多为真菌病害。为了更加科学制定合理的防控措施，对病害种类的确认是最为必要的前提，因此快速准确鉴定病原菌就显得尤为重要。 

棉花病原真菌传统的鉴定是以形态学、细胞学、生理学和生态学等特征为根据的，但是由于很多真菌生物学性状极其相似，因此，要求科研工作者具有丰富的实践经验，同时，传统的鉴定还较为费时、费力。随着分子生物学的发展，核糖体内部转录间隔区(Internal transcribed spacer，ITS)扩增、克隆测序，大大提高了病原真菌鉴定的准确性，但仍存在实验周期较长，成本较高的问题。完成ITS克隆、测序、比对一系列程序需要大约一周，且一个样品的鉴定费用大约是40元。 

虽然采用ITS-RFLP方法鉴定病原真菌已经有文献进行报道，由于棉花病原真菌基因上的相似性，存在严重的相互干扰，因此如何针对棉花病原真菌的特点，选择合适的引物以及内切酶来提高鉴定的准确性仍然是本领域的技术人员亟待解决的技术问题。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法，快速而又准确的鉴定棉花病原真菌的种类，为病害的有效防控提供依据。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法，选择棉花主要病害的病原真菌，包括棉花黄萎病、枯萎病、立枯病、红腐病和红粉病所对应的病原菌大丽轮枝菌、黑白轮枝菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、串珠镰刀菌和粉红单端孢，并测定以上病原真菌的ITS序列；利用Webcutter在线分析选择酶切带谱类型各异的限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、 Sau3A，结合pDRAW32软件，对酶切产物分布情况进行分析，并绘制出2-4％的琼脂糖凝胶电子酶切图谱，作为比对使用的标准图谱； 

随后提取待测棉花样品的病原真菌的基因组DNA，采用如下引物对所提取的DNA进行PCR扩增； 

ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’： 

ITS5：5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’： 

扩增产物使用限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A分别酶切，并采用与前述琼脂糖凝胶相同浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，并将酶切结果和电子标准图谱比对，鉴定病原真菌种类。 

其特征在于包括下述步骤： 

表1棉花主要病害和病原真菌列表 

在本发明的一个优选实施方式中，所述的鉴定步骤包括如下步骤： 

1)DNA的提取：将分离纯化的棉花病原真菌接种至PDA培养基，28℃恒温静置培养，收集菌丝，收集棉花病原真菌的菌丝，采用CTAB-NaCl方法抽提，用ddH₂O溶解基因组DNA 

2)PCR扩增：以上述病原真菌的基因组DNA为模板，采用引物对ITS4 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’和ITS5 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’进行PCR扩增。20μl的PCR反应体系：包括10×PCR buffer(Mg²⁺)2μl，浓度为10mM的dNTP溶液1.6μl，浓度为10uM引物ITS4／ITS5各1μl，基因组DNA1μl，浓度为5U／μl的Taq酶0.2μl，以及13.2μl的ddH₂O。扩增反应程序为：94℃预变性2min，之后，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共25个循环，最后72℃延伸10min，得到ITS的PCR产物，产物大小范围为500-750bp。 

3)酶切反应：任意使用限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A对ITS的PCR产物酶切。10μl的酶切体系：ITS模板6μl，10×内切酶buffer1μl，内切酶0.5μl、ddH₂O 2.5μl。反应条件为：PCR仪中37℃保温1h，加入2μl的6×loading buffer终止反应，3％琼脂糖凝胶电泳恒压75V，2小时，在紫外灯下观察拍照，获得ITS-RFLP带谱；