[发明专利]用于SMA基因筛查的引物、探针及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及用于人类脊髓性肌萎缩症（SMA）基因筛查的引物、探针及其使用方法。

背景技术

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是一组以脊髓前角运动神经元退行性病变为病理特征的常染色体隐性遗传病，临床表现为进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力、萎缩和瘫痪，新生儿发病率为1/6000～1/10000，在正常人群中基因携带者的发生率为1/40～1/60，居致死性常染色体隐性遗传病第二位，仅次于囊性纤维变。

根据发病年龄和临床表现，可将SMA分为四型：（1）Ⅰ型SMA（急性型）：出生后6个月内发病，全身肌肉无力，肌张力减退，患儿不能坐和站立，通常在2岁内死于呼吸衰竭；（2）Ⅱ型SMA（中间型）：出生后6～18个月间发病，患儿能坐但不能独自行走，预期寿命显著降低；（3）Ⅲ型SMA（少年型）：患儿能坐和行走，多数表现有肌力弱，预期寿命不减少，成年后仍经常需要依靠拐杖或轮椅代步；（4）Ⅳ型SMA（成人型）：30岁后发病，症状极轻，寿命正常。其中Ⅰ～Ⅲ型称为儿童型SMA，是婴幼儿期最常见的致死性常染色体隐性遗传病之一，目前尚无特效治疗手段。

研究发现，定位于染色体5q11.2～13.3区域的运动神经元存活基因（survival motor neuron gene，SMN）是SMA发病的决定性基因。SMN基因全长20kb，含8个外显子，其转录产物约1700bp，编码294个氨基酸。该基因在5号染色体上有2种拷贝，在端粒侧的称为SMN1（即SMNt），在着丝粒侧的称SMN2（即SMNc），两者间具有高度的同源性，仅有5个碱基对的差异。SMA发病主要是由于SMN基因发生缺失、点突变等基因异常所致。研究表明，SMN1基因是SMA的致病基因，大多数（90.0～98.6%）患者有SMN1基因第7、8外显子或单纯第7外显子的纯合缺失或突变；而SMN2基因是SMA症状轻重的调节基因，其拷贝数与SMA病情的严重程度有关，轻型SMA患者比重型SMA具有更多的SMN2拷贝数，即SMN2能在一定程度上弥补SMN1缺失所造成的功能缺陷。由于SMA属于染色体隐性遗传病，若夫妻皆为SMA致病基因携带者，则胎儿无论男女皆有1/4的概率为SMA患者，1/2的概率为SMA致病基因携带者，另1/4的概率为正常。因此，筛查具有SMA家族病史者的SMA致病基因存在状态，对夫妻双方均为SMA致病基因携带者的胎儿进行产前诊断，对于防治SMA、推进优生优育、提高人口素质具有重要意义。

过去，SMA的临床确诊主要依靠临床病史、体征及肌电图和肌活检综合诊断，误诊率和漏诊率很高。

近年来，分子生物学技术的飞速发展为SMA遗传学研究提供了新的途径和方法，使对该疾病的基因诊断和产前诊断成为可能。目前对SMA致病基因进行检测的方法包括聚合酶链式反应-单链构象多态性技术（PCR-SSCP）、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析技术（PCR-RFLP）、变性高效液相色谱法（DHPLC）、多重连接依赖式探针扩增技术（MLPA）、实时荧光定量聚合酶链式反应技术（Real-Time PCR）等。但是，PCR-SSCP技术实验要求高，电泳时温度的变化等可通过影响单链DNA的折叠而易造成假阳性或假阴性结果，使其在临床实验室的应用受到限制；PCR-RFLP技术用于临床基因检测操作步骤繁琐，需要对PCR产物进行后处理，在操作过程中易发生污染，且存在酶切不完全和扩增时产生异源双链而不能酶切所造成的假阴性结果，也无法检测SMN1基因的杂合性缺失，因而无法区分SMA致病基因携带者和正常人；DHPLC法用于SMA致病基因检测，只能检测杂合突变，由于检测体系敏感，易导致检测失败或结果重复性不好，且因SMN基因的拷贝数波动较大，数据分析存在一定问题；MLPA技术应用于SMA致病基因检测，不仅可检测出SMN基因的拷贝数，还能判断杂合子和纯合子缺失，此外由于具有半定量作用，能检测出致病基因携带者，且具有准确性高、重复性好及简便快速等优点，该方法结合DNA测序技术，可使基因诊断结果更为准确可靠，但MLPA也有其局限性：1、需要精确测量DNA的浓度，样本容易被污染；2、不能用于单个细胞的检测；3、不能检测染色体的平衡易位。

Real-Time PCR法可有效应用于SMA致病基因拷贝数检测，其最大优点是可对基因拷贝数进行定量分析，且实验过程操作简便快捷，可有效避免PCR产物遗留污染。由于基因分析的定量化是未来基因诊断的发展趋势，Real-Time PCR技术在基因定量分析方面的先天优势使其具有极大的临床应用价值，将越来越广泛的应用于临床实践。

发明内容